Caracterização molecular de um inibidor de proteases do barbeiro Triatoma infestans que interfere na invasão celular pelo parasita Trypanosoma cruzi

Caracterização molecular de um inibidor de proteases do barbeiro Triatoma infestans que interfere na invasão celular pelo parasita Trypanosoma cruzi

Alternative title Molecular characterization of a protease inhibitor from kissing bug Triatoma infestans which interfere with the cell invasion of parasite Trypanosoma cruzi
Author Lovato, Diogo Ventura Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Tanaka, Aparecida Sadae Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Ciências Biológicas (Biologia Molecular) – São Paulo
Abstract As infestinas são inibidores de serinoproteases do tipo Kazal encontrados no intestino médio anterior do barbeiro Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae), um dos principais vetores da doença de Chagas. Neste trabalho, o cDNA do precursor das infestinas foi clonado mostrando a presença de um peptídeo sinal hipotético e sete domínios de inibidores de proteases do tipo Kazal sendo quatro correspondentes as infestinas 1-2 e infestina 3-4, e três novos domínios. Por análise em Northern blot, foi confirmada a síntese de apenas um transcrito de infestina 1-7, de aproximadamente 1800 pb, no intestino médio anterior do inseto. Os três novos domínios de infestina foram denominados de infestina 1R, 2R e 3R. As infestinas 2R-3R são 77% idênticas em seqüência de aminoácidos a infestina 1-2. Em contraste as demais infestinas, a infestina 1R apresenta duas características diferentes marcantes: 1) aminoácido hidrofóbico na posição P1 do sítio reativo do inibidor e, 2) ser processado como um domínio único do tipo Kazal de acordo com predição. Estas duas características foram demonstradas experimentalmente pela purificação da infestina 1R nativa de intestino de T. infestans a qual inibiu elastase de neutrófilos, quimotripsina e subtilisina A e a análise por espectroscopia de massas confirmou o processamento como um único domínio do tipo Kazal. A infestina 1R recombinante foi expressa em bactéria E. coli e apresentou a mesma constante de dissociação para elastase de neutrófilos em relação a proteína nativa. rINF1R também foi capaz de inibir subtilisina A, quimotripsina e proteinase K, mas não foi capaz de inibir trombina nem os ensaios de coagulação (TP e TTPA). Procurando pela função biológica de infestina 1R e atividades biologicas da molecula, verificamos que a forma recombinante foi capaz de interagir com o parasita da doenca de Chagas Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) ligando-se as formas tripomastigotas de T. cruzi e interferiu na invasao de celulas epiteliais em cultura. Na concentracao final de 10 ƒÊM, rINF1R bloqueou completamente a invasao e, na mesma concentracao, foi capaz de inibir o crescimento das formas epimastigotas em cultura. Para elucidar qual regiao de rINF1R era responsavel por esta atividade, um peptideo ciclico contendo a regiao do sitio reativo de rINF1R baseado na estrutura de SFTI-1 (Sun Flower Trypsin Inhibitor 1) denominado 1RSFTI foi sintetizado o qual tambem foi capaz de interferir na invasao celular de T. cruzi. Ensaios de invasao de celulas LLCMK2 por T. cruzi cepa Y utilizando diferentes inibidores de proteases sugerem que atividade proteolitica do tipo subtilisina pode ser importante para a invasao de celulas por T. cruzi. O perfil de expressao do precursor das infestinas alimentando artificialmente com sangue humano contendo extrato das formas tripomastigotas de T. cruzi mostrou aumento de expressao de duas vezes apos 12 h em relacao aos que se alimentaram apenas com sangue nas mesmas condicoes.
Keywords Coagulação sanguínea
Inibidores de proteases
Invasão
Trypanosoma cruzi
Triatoma
Language Portuguese
Date 2008-04-30
Published in LOVATO, Diogo Ventura. Caracterização molecular de um inibidor de proteases do barbeiro Triatoma infestans que interfere na invasão celular pelo parasita Trypanosoma cruzi. 2008. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2008.
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 131 p.
Access rights Open access Open Access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/9191

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