Vitamina D: a influência na matriz extracelular do tecido conjuntivo de sustentação dos órgãos pélvicos

Vitamina D: a influência na matriz extracelular do tecido conjuntivo de sustentação dos órgãos pélvicos

Author Kemp, Marta Maria Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Girao, Manoel Joao Batista Castello Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Medicina (Ginecologia)
Abstract Hypothesis/aims of study: Vitamin D deficiency is largely spoken of as being associated with several different diseases. Most of the associations are inferred by the levels of 25(OH)D in the plasma, which has no direct correlation to the activity of its active metabolites, i.e. 1,25(OH)D, since it follows the patterns of a steroid hormone, with negative and positive feedbacks and other molecular interactions, instead of behaving as a vitamin. Pelvic organ prolapse has also been linked to lower serum levels of vitamin D, although the exact mechanism for this increase in risk is not totally understood. One of the potential mechanisms for this increased risk is the influence vitamin D has on the architecture of the extracellular matrix (ECM) main component of the structures of the pelvic support apparatus and responsible for its mechanical properties. The aim of this study was to examine the arrangement of collagen fibers, the most prevalent fibrous protein present in the ECM at the endopelvic fascia, and other structural components of the ECM and cytoskeleton of the endopelvic fascia, to capture any different morphological pattern between subjects with a normal diet and those under a vitamin D supplementation. Collagen quantification was also performed. Study design, materials and methods: This hypothesis was investigated using female healthy adult Wistar rats (8 weeks old, approximately 200-220g). The treatment group received cholecalciferol diluted in arachid oil by gavage (in the dose 37.5mcg/Kg/day, equivalent to 1,500Ui/Kg/day), and the control group received only the oil, for 18 consecutive days. Twenty-four hours after the last gavage procedure, euthanasia was performed and a surgical procedure was undertaken extracting, as a bloc, the lower third of the uterus with the uterosacral ligament, the upper half of the vagina with the connective tissue surrounding and the bladder with proximal urethra. Samples were immersed in Tissue-Tek and cut in 30 and 50 micrometer thick slices and placed on the sheets for microscopic evaluation with SHG (second harmonic generation) technique, which requires no tissue preparation. For the purpose of interpretation, the rats were also separated into groups according to the estrous phase: high estrogenic influence (proestrus and estrus) and low estrogenic influence (metaestrus and diestrus) identified by cytology and histology under conventional light microscopy. Collagen by Picrosirius and antibodies for other extracellular structural components were also performed. Tissues were analyzed using Confocal Microscope (TCS SP8 CARS from Leica) and F and Epi-SHG detectors were used to detect SHG signals from collagen fibers. Images are represented as maximum intensity projections, corresponding to the Z-series of confocal stacks and were collected by tile scan and processed with Leica LAS AF software and, posteriorly, manipulated with ImageJ software. Results: We found that collagen fibers have a consistently undulated pattern and more random disposition in the xvi treated group whereas in the control group it assumes a more taut and oriented appearance, when under high estrogenic influence. The collagen signal from SHG was statistically more intense in the treated group compared to the control group also under a high estrogenic environment. The extracellular components alpha-actin, heparan sulfate and glicoconjugates containing sialic acid and N-acetylgkucosamine residues also showed clear different images when comparing control and treated groups. Conclusion: These findings suggest that there is a difference in the morphological presentation of the extracellular matrix of subjects under high dose intake of vitamin D compared to subjects under normal intake of the vitamin, pointing to a probable change in the mechanical properties of the tissue and that there might be an interaction of the metabolic pathways of the two steroid hormones cholecalciferol and estrogen at least regarding the amount of collagen deposited in the tissue. Not only the collagen, other components of the ECM presented differently in the treated and control groups. Oral high dose intake of vitamin D changes the framework and composition of the extracellular matrix at the level of the endopelvic fascia, which can impact the properties and resilience of the tissue. In summary, new research are needed in the biomechanical field to approach a clinical significance but we have shown a tangible relation between vitamin D exposure and collagen fiber architecture.

Introdução: A deficiência da vitamina D tem sido amplamente associada a inúmeras doenças. A maior parte das associações é inferida pelos níveis de 25(OH)D no plasma sanguíneo, substância que não tem relação direta com a atividade dos seus metabólitos – tal como a 1,25(OH)D – já que segue os padrões dos hormônios esteroidais, com “feedbacks” positivos e negativos e outras interações moleculares, em vez de seguir o comportamento das vitaminas. O prolapso de órgão pélvico também foi associado aos baixos níveis séricos da vitamina D e, apesar de o mecanismo exato para esse aumento do risco não ser completamente compreendido, a influência da vitamina D na arquitetura da matriz extracelular (MEC), principal componente do aparato de suporte pélvico e responsável por suas propriedades mecânicas, é uma hipótese. Objetivos: O objetivo deste estudo foi examinar a estrutura da matriz extracelular por meio do arranjo das fibras de colágeno - proteína fibrosa mais prevalente dessa matriz -, e outros componentes estruturais da MEC e citoesqueleto da fáscia endopélvica, para observar diferentes padrões morfológicos em animais em regime dietético normal e sob suplementação de vitamina D. A quantificação do colágeno também foi avaliada. Casuística e métodos: Foram investigadas ratas Wistar adultas (8 semanas de idade com peso entre 200-220g). O grupo tratado recebeu, por gavagem, colecalciferol diluído em óleo de amendoim (na dose de 37.5mcg/Kg/dia, equivalente a 1.500Ui/Kg/dia), e o grupo controle recebeu apenas o óleo, por 18 dias consecutivos. Vinte e quatro horas após o último procedimento de gavagem, foi realizada eutanásia e procedimento cirúrgico com exérese, em bloco, do terço inferior do útero e superior da vagina, base da bexiga com porção proximal da uretra e o tecido conjuntivo adjacente. As amostras foram seccionadas em cortes espessos de 30 e 50 micrômetros e colocadas nas lâminas para avaliação microscópica com a técnica de geração de segunda harmônica (SHG), a qual não requer preparo dos tecidos. Para propósito de interpretação, as ratas foram separadas em grupos, conforme a fase do ciclo estral, alta ação estrogênica (proestro e estro) e baixa ação estrogênica (metaestro e diestro), identificadas por citologia e histologia. As técnicas de Picrosirius para análise do colágeno e marcações com anticorpos para outros componentes estruturais da MEC também foram utilizadas. Os tecidos foram analisados por Microscopia Confocal (TCS SP8 CARS da Leica), utilizando detectores F e Epi-SHG para detecção do sinal de SHG das fibras de colágeno. As imagens são representadas por projeções de intensidade máxima, correspondentes às imagens da série Z, coletadas pela varredura dos tecidos e processadas, utilizando o software Leica LAS AF e, posteriormente, o software ImageJ. Resultados: As fibras de colágeno apresentam xiv padrão ondulado consistente e disposição aleatória no grupo tratado, enquanto o grupo controle assume aparência organizada e orientada, quando sob alta ação estrogênica. O sinal referente a SHG das fibras de colágeno mostrou-se significativamente mais intenso no grupo tratado, comparado ao grupo controle também, quando em um ambiente altamente estrogênico. A marcação de alfa-actina, heparam sulfato e de glicoconjugados contendo resíduos de ácido siálico e de N-acetil-glucosamina) mostraram padrões claramente diferentes entre os grupos controle e tratado. Conclusões: Os achados evidenciam diferença na apresentação morfológica da MEC dos animais sob dieta com alta dose de vitamina D, comparados àqueles com ingesta habitual da vitamina, apontando para uma provável mudança nas propriedades mecânicas do tecido e possível interação entre os caminhos metabólicos dos dois hormônios esteroidais, colecalciferol e estrogênio, ao menos no que tange à quantidade de colágeno depositada no tecido. Além do colágeno, outros componentes estruturais da MEC mostraram-se diferentes nos grupos controle e tratado. Administração oral de altas doses de vitamina D altera a organização e a composição da matriz extracellular na fáscia endopélvica, o que pode impactar nas propriedades e resiliência do tecido. Novas pesquisas são necessárias para avaliar o significado clínico do achado, mas mostramos uma relação tangível entre a exposição à vitamina D e a arquitetura das fibras de colágeno na matriz extracelular.
Keywords Extracellular-Matrix
Pelvic Organ Prolapse
Animal Study
Molecular Biology
Hormone Therapy
Matriz Extracelular
Prolapso Genital
Estudo Em Animais
Biologia Molecular
Terapia Hormonal
Language Portuguese
Date 2019-11-01
Research area Ciências Ômicas, Microbioma, Biomarcadores, Biologia Celular, Biologia Molecular E Terapia Celular Em Estudos Clínicos E Experimentais
Knowledge area Ginecologia/Mastologia
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 120 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=8105359
Access rights Open access Open Access
Type Thesis
URI https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/60057

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