Investigação da expressão de microRNAs nos espermatozoides de ratos wistar modelo de transtorno do espectro do autismo induzido por ácido valproico

Investigação da expressão de microRNAs nos espermatozoides de ratos wistar modelo de transtorno do espectro do autismo induzido por ácido valproico

Author Roloff, Helena Bertazolli Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Teixeira, Taiza Stumpp Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Biologia Estrutural e Funcional
Abstract Epigenetics deals with changes in the genome that do not alters the sequence of base pairs of DNA, but affect the modulation of gene expression. These modifications can occur in different ways, including DNA methylation and post-transcriptional regulation by microRNAs (miRNAs), which modulate messenger RNA (mRNA) activity. The miRNAs have been identified as potential biomarkers for the diagnosis and evaluation of response of psychiatric disorders. Among psychiatric syndromes, ASD (Autism Spectrum Disorder) is a neurodevelopmental disorder that involves a broad spectrum of clinical phenotypes and a complex genetic contribution. Many miRNAs differentially expressed in this disorder are involved in neuronal differentiation, maturation and proliferation, so that their dysregulation may be associated with the neurodevelopmental deficits observed in ASD. The environmental factors involved in the ASD etiology may be pre- or postnatal, highlighting, in the present study, in utero exposure to the teratogenic drug valproic acid (VPA), a broad spectrum anticonvulsant drug. VPA acts through epigenetic mechanisms and studies have been using prenatal exposure to VPA in animals to produce a model of autism that presents a constructive and face validity. Two important events of epigenetic reprogramming occur during embryonic development: the first immediately after fertilization and the second during the development of primordial germ cells (PGCs), which are the precursors of gametes. During this reprogramming period, PGCs become more susceptible to epigenetic changes, which can remain in the gametes and can be passed on to the next generation and generate an epigenetic inheritance mechanism. It is important to mention that during the epigenetic reprogramming of PCG, alternative silencing mechanisms of retrotransposons, whose expression is controlled by methylation, need to be activated. Thus, impairments during this process may lead to inappropriate mobilization of retrotransposons, which may result in mutations and other important changes in the genome. Copy number variations of retrotransposon Line-1 (long interspersed element 1), for example, are considered a possible cause of neurobehavioral disorders, such as ASD. Aim: Given these data, it was decided to use the ASD model based on the treatment with valproic acid to investigate the expression of miRNAs related to this disorder, as well as to investigate possible XIII changes in the number of Line-1 copies in the spermatozoa of these animals. Methods: For this, Wistar rats were treated with 800mg / kg VPA at 12.5 days post-conception (dpc). Male descendants were submitted to basic behavioral tests to verify the induction of behaviors that could confirm the model. The spermatozoa, pre-frontal cortex and cerebellum of the male offspring from these rats were collected and subjected to miRNA or DNA extraction. The testicles were also collected and fixed in Bouin's liquid for morphological analysis. The expression of miR-132-5p, miR-106b-5p, miR-182, miR-18a-5p, miR-34a-5p, miR134-5p, miR219a-5p, miR3596 e miR-195-5p was evaluated. Expression changes those miRNAs has been described in patients with ASD or other psychiatric disorders. For this analysis, TaqMan assays were used. The extracted DNA was used for the analysis of the number of copies variation (CNV) of Line-1 by qPCR with Sybr assays. Results: The results show that the male offspring of VPA treated rats present behavioral changes, although it was not possible to carry out more conclusive tests because they caused stress, which could add more bias to the experiment. These animals presented significant alterations in sperm morphology when compared to controls, although they did not show relevant testicular morphological alterations. The miRNAs miR-132-5p, miR-106b-5p, miR-182, miR-34a-5p, miR134-5p, miR219a-5p, miR3596 and miR-195-5p had reduced expression in cerebellar samples from VPA animals compared to CT animals. There was no change in the expression of any of the nine miRNAs comparing pre-frontal cortex samples from VPA and CT animals. Expression of miRNAs miR-132-5p, miR-34a-5p and miR-219a-5p was shown to be altered in the spermatozoa of the offspring of VPA-treated females in contrast to CT animals. Unfortunately, no results could be obtained from the investigation of the number of Line-1 copies in brain and sperm samples. Conclusion: With this study, it was possible to establish strategies and obtain basic data to study mechanisms of epigenetic inheritance of ASD in animal models.

A epigenética trata de mudanças no genoma que não alteram a sequência de pares bases de DNA, mas afetam a modulação da expressão gênica. Essas modificações podem se dar de diferentes formas, incluindo metilação do DNA e regulação pós-transcricional por microRNAs (miRNAs), os quais modulam a atividade de RNA mensageiro (mRNA). Os miRNAs têm sido apontados como potenciais biomarcadores para o diagnóstico e avaliação de resposta de transtornos psiquiátricos. Dentre as síndromes psiquiátricas, o TEA (Transtorno do Espectro do Autismo) é um transtorno de desenvolvimento neurológico que envolve um espectro amplo de fenótipos clínicos e contribuição genética complexa. Muitos miRNA diferencialmente expressos neste transtorno estão envolvidos na diferenciação, maturação e proliferação neuronal, de forma que sua desregulação pode estar associada com os déficits de desenvolvimento neurológico observados no TEA. Os fatores ambientais envolvidos na etiologia do TEA podem ser de caráter pré ou pós-natais, destacando-se, no presente estudo, a exposição in útero ao medicamento teratogênico ácido valproico (VPA), um fármaco anticonvulsivo de amplo espectro. VPA age através de mecanismos epigenéticos e estudos vêm se utilizando da exposição pré-natal ao VPA em animais para produzir um modelo de autismo que tem uma validade de construção e face. Durante o desenvolvimento embrionário, dois importantes eventos de reprogramação epigenética ocorrem: o primeiro imediatamente após a fecundação e o segundo durante o desenvolvimento de células germinativas primordiais (CGP), que são as precursoras dos gametas. Durante este período de reprogramação, as CGP se tornam mais suscetíveis a alterações epigenéticas, as quais podem permanecer nos gametas e serem passadas à geração seguinte e gerar um mecanismo de herança epigenética. É importante mencionar que, durante a reprogramação epigenética das CGP, mecanismos alternativos de silenciamento de retrotransposons, cuja expressão é controlada por metilação, precisam ser ativados. Assim, prejuízos durante este processo podem levar a mobilização inadequada dos retrotransposons, o que pode resultar em mutações e outras alterações importantes do genoma. Variações no número de cópias do retrotransposon Line-1 (long interspersed element 1), por exemplo, são consideradas uma possível causa de transtornos X neurocomportamentais, a exemplo do TEA. Objetivos: Diante desses dados, decidiu-se utilizar o modelo de TEA baseado no tratamento com ácido valproico para investigar a expressão de miRNAs relacionados a esse distúrbio, bem como investigar possíveis alterações de número de cópias de Line-1 nos espermatozoides desses animais. Métodos: Para isso, ratas Wistar foram tratadas com 800mg/Kg de VPA aos 12,5 dias pós-concepção (dpc). Os descendentes do sexo masculino foram submetidos a testes comportamentais básicos para verificação da indução de comportamentos que pudessem confirmar o modelo. Os espermatozoides, córtex pré-frontal e cerebelo das proles masculinas provenientes dessas ratas foram coletados e submetidos a extração de miRNA ou DNA. Os testículos também foram colhidos e fixados em líquido de Bouin para análise morfológica. Foi avaliada a expressão dos miRNA miR-132-5p, miR-106b-5p, miR-182, miR-18a-5p, miR-34a-5p, miR134-5p, miR219a-5p, miR3596 e miR-195-5p, cuja alteração da expressão foi descrita em pacientes enquadrados nos TEA ou em outros transtornos psiquiátricos. Para esta análise foram utilizados ensaios TaqMan. O DNA extraído foi destinado à análise do número de cópias (CNV) de Line-1 através de qPCR com ensaios Sybr. Resultados: Os resultados obtidos revelam que a prole masculina das ratas tratadas com VPA apresentam alterações comportamentais, embora testes mais contundentes não pudessem ser realizados por serem causadores de estresse, o que poderia adicionar mais vieses ao experimento. Esses animais apresentaram alterações bastante significativas da morfologia dos espermatozoides quando comparados aos controles, embora não tenham mostrado alterações morfológicas testiculares relevantes. Os miRNAs miR-132-5p, miR-106b-5p, miR-182, miR-34a-5p, miR134-5p, miR219a-5p, miR3596 e miR-195-5p tiveram expressão reduzida em amostras cerebelares de animais VPA em comparação aos animais CT. Não houve alteração na expressão de nenhum dos nove miRNAs comparando amostras de córtex-pré-frontal de animais VPA e CT. A expressão dos miRNAs miR-132-5p, miR-34a-5p e miR-219a-5p se mostrou alterada nos espermatozoides dos descendentes de fêmeas tratadas com VPA em contraste com animais CT. Infelizmente, nenhum resultado pôde ser obtido da investigação do número de cópias Line-1 nas amostras cerebrais e espermáticas. Conclusões: Com este estudo, foi possível estabelecer estratégias e obter dados de base para estudar mecanismos de herança epigenética de TEA em modelos animais.
Keywords microRNA (miRNA)
Spermatozoa
Transgenerational Epigenetic Inheritance
Long Interspersed Element 1 (Line-1)
autism spectrum disorder (ASD)
valproic acid (VPA)
microRNA (miRNA)
Espermatozoide
Herança Epigenética Transgeracional
Long Interspersed Element 1 (Line-1)
transtorno do espectro do autismo (TEA)
ácido valproico (VPA)
Language Portuguese
Date 2019-05-30
Research area Biologia Reprodutiva
Knowledge area Biologia Celular E Molecular
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 91 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=8739891
Access rights Closed access
Type Dissertation
URI https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/59788

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