Transplante do epitélio pigmentado da retina derivado de células tronco - embrionárias em modelo animal de grande porte estudos pré-clínicos

Transplante do epitélio pigmentado da retina derivado de células tronco - embrionárias em modelo animal de grande porte estudos pré-clínicos

Author Fernandes, Rodrigo Antonio Brant Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Maia, Mauricio Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Oftalmologia e Ciências Visuais
Abstract Objectives: To assess the cell safety, survival and feasibility of the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium (hESC-RPE) in Yucatan minipigs and to determine the surgical technique to be used in humans. Also the cell culture methods were replicated in Brazil, and the stem cells derived REP cells were modified to express the fluorescent protein cGMP. Methods: Ultrathin films made from parylene C were seeded with hESC-RPE and implanted in the subretinal space of immunosupressed Yucatan minipigs. Four studies were designed, completed and published. The first study assessed the viability of the surgical procedure and the first version of the tissue injector, along with the correct positioning of the implant. The compatibility of its dimensions with the human eye and the tissue integrity after placement were evaluated through ocular imaging (Optical Coherence Tomography (OCT)) and histological examination (n=8). Three months after implantation, when the animals were sacrificed, adjacent sections were processed for immunohistochemical analysis using TRA-1-85 (human blood group antigen) and DAPI antibodies. In the second study, we reported the evolution of the tissue injector and the implant dimensions using the data gathered in the first study, with its final formats determined for the human clinical trial. We performed acute surgical procedures, along with ocular imaging of the impacted eyes. The animals were sacrificed after the image acquisitions and the eyes were evaluated histologically. In this study, the cell survival and possible tumor formation were evaluated in animals submitted to the implantation of parylene C seeded with ESC-RPE in the final dimensions to be used in the human clinical trial. In the fourth study we described the method for differentiation and enrichment of hESC-RPE in Brazil. Results: In the first study, the RPE monolayer seeded in the parylene C substrate proved positive to TRA- 1-85 and RPE-65 three months after implantation, showing cell viability after this follow-up period without adverse effects. The cells didn’t migrate outside the substrate and there were neither tutor formation locally nor other body tissues or organs. In the second study, the new modifications on the substrate and injector were evaluated in an acute surgical procedure, where the animals were sacrificed immediately after the surgical procedure and ocular image acquisition. There was no tissue damage to the surrounding ocular tissues due to the surgical technique and there was minimal cell loss over the substrate. In the third study, animals were implanted with the final format of the substrate and tissue injector, with a control group receiving only subretinal saline, and were kept immunosuppressed with cyclosporine for one month, and then sacrificed. No adverse events were observed and the cells proved positive to TRA-1- 85 and RPE-65 after one month of follow-up. No difference was found histologically between the implanted animals and the controls. In the fourth study we described the method for differentiation and enrichment of hESC-RPE in Brazil. The method produced a yield of 108 cells, and the cells exhibited all the biomarkers and gene expression of adult RPE cells. Conclusion: The hESC-RPE cells survived for at least three months in this animal model. The surgical procedure and subretinal implantation of the substrate with cells were feasible and safe without migration of the substrate or the induction of tumors in the eyes and organs of the immunosuppressed animals. The method for differentiation and enrichment proved reliable and replicable, with the cells expressing the biomarkers of adult RPE cells.

Objetivos: Desenvolver a técnica cirúrgica, avaliar a segurança e a sobrevivência do transplante de células do epitélio pigmentado da retina derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESC-RPE) semeado em um substrato de parylene C no espaço sub-retiniano de animais de grande porte (Yucatan minipigs). Métodos: Filmes ultrafinos de parylene C, semeados com hESC-RPE, foram implantados cirurgicamente no espaço sub-retiniano dos Yucatan minipigs, dando origem a quatro estudos publicados. No primeiro estudo, a viabilidade do procedimento cirúrgico, a primeira versão do injetor tecidual, o correto posicionamento do implante, a compatibilidade de suas dimensões e o dano aos tecidos oculares foram analisados por meio de estudos de histologia e de imagens de tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) em animais imunossuprimidos (n=8) sacrificados após três meses da implantação. Foi realizada análise imuno-histoquímica para avaliar a expressão de anticorpos TRA-1-85 (human blood group antigen) e DAPI. No segundo estudo, reportou-se a evolução do injetor tecidual e das dimensões do implante adequado ao uso no estudo clínico. Foram realizadas imagens imediatamente após o procedimento cirúrgico (Infrared e SD-OCT) para a avaliação in vivo das células implantadas (n=12). Os animais foram sacrificados imediatamente, e os tecidos, enviados para análise histológica e imuno-histoquímica para avaliar se houve dano aos tecidos oculares ou perda celular sobre o implante. No terceiro estudo, foram avaliadas a sobrevivência celular e a formação de tumores em animais imunossuprimidos (n=11), comparando o resultado com o de animais que foram submetidos ao procedimento cirúrgico sem o implante (controles). Foram utilizadas as versões finais do injetor e do implante que serão analisadas no estudo clínico. No quarto estudo, descrevemos os métodos de diferenciação de células embrionárias em epitélio pigmentado da retina in vitro, com a caracterização das células através de biomarcadores, estudo realizado inteiramente no Brasil. Resultados: No primeiro estudo, a monocamada de epitélio pigmentado da retina (EPR), semeada no substrato de parylene C, mostrou-se imunopositiva para TRA-1-85 e RPE-65 três meses após a implantação cirúrgica, apresentando a viabilidade celular após esse período sem eventos adversos. As células não migraram para fora do substrato e não houve formação de tumores no local nem em tecidos periféricos. Análise dos órgãos não mostrou evidência de tumores. Alguns animais apresentaram opacidade total de córnea no follow-up devido a ceratite de exposição, o que impossibilitou a realização de exames de imagem no follow-up. No segundo estudo, as novas modificações do substrato e do injetor foram avaliadas de forma aguda, e não foram verificadas lesões aos tecidos oculares relacionadas à manipulação cirúrgica, com perda celular mínima sobre o substrato. No terceiro estudo, mediante análises de histologia e de imagem ocular, houve sobrevivência celular pelo período de um mês após a implantação, já com a utilização dos modelos finais de injetor e substrato. Não houve diferença nos achados histológicos entre os implantados e os controles; e as células mostraram marcadores típicos de EPR humanos, TRA-1-85 e RPE-65. No quarto estudo, os métodos de diferenciação foram descritos em condições cGMP, utilizando-se meios e condições xeno free. Método demonstrou-se viável, com a colheita de 108 células após as fases de diferenciação e enriquecimento, com as células exibindo o formato característico de paralelepípedos e expressando os marcadores celulares e expressão gênica típica de células de EPR adultas. Conclusão: O procedimento cirúrgico mostrou-se seguro e reprodutível, com perda celular mínima sobre o implante, com as primeiras e segundas versões dos injetores e substratos teciduais. As células hESC-RPE sobreviveram por até três meses no espaço sub-retiniano dos Yucatan minipigs. O procedimento de diferenciação e enriquecimento in vitro de produção de hESC-RPE mostrou-se viável e reprodutível em solo nacional.
Keywords Retinal Pigment Epithelium
Human Embryonic Stem Cell-Derived
Stem Cells
Animals
Células-Tronco Embrionárias Humanas (hESC-RPE)
Medicina Regenerativa
Epitélio Pigmentado Da Retina
Degeneração Macular
Animais
Language Portuguese
Date 2019-12-18
Research area Farmacologia E Fotodinâmica Aplicada Á Inibição Da Proliferação Neovascular Retiniana E Sub-Retiniana.
Knowledge area Análise Da Eficácia De Protocolos De Intervenção
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 83 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=8072461
Access rights Closed access
Type Thesis
URI https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/59731

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