Avaliação funcional do gene PIK3CA (fosfatidilinositol-3-quinase, subunidade catalítica alfa) em células endoteliais resistentes ao Anoikis

Avaliação funcional do gene PIK3CA (fosfatidilinositol-3-quinase, subunidade catalítica alfa) em células endoteliais resistentes ao Anoikis

Author Mesquita, Ana Paula De Sousa Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Azevedo, Carla Cristina Lopes De Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Ciências Biológicas (Biologia Molecular)
Abstract The development, differentiation and homeostasis of adherent cells are controlled by cell-cell, cell-extracellular matrix (ECM) and cell-soluble factors interactions. The loss of these contacts induces to anoikis, an apoptosis specific type. Tumor cells acquire resistance to anoikis, survival after loss of anchorage and invasion of the vascular system, colonizing distant organs. This process is called metastasis. Activation of the PI3K / Akt signaling pathway is the most common mechanism involved in the acquisition of anoikis resistance by cancer cells. Thus, this pathway represents an opportunity and a challenge for cancer therapy. Previous studies from our group reported that the acquisition of anoikis resistance by endothelial cells from rabbit aortic trigger morphological changes, high proliferation rate, poor adhesiveness to fibronectin, laminin and collagen IV, high invasiveness, low apoptosis rate, and dysregulation of cell cycle. In addition, anoikis resistant cell lines exhibit up-regulation of the Ras/ERK and PI3K/Akt pathways. This is accompanied by an extensive remodeling of the MEC. The role of PI3K in cancer was highlighted by the observation that the gene encoding the p110α catalytic subunit is often mutated in the most common human cancers. In this study, we aim to elucidate the role of the p110α catalytic subunit PI3K protein in the acquisition of the anoikis-resistant phenotype and in the regulation of cellular characteristics directly related to tumorigenesis such as apoptosis rate, cell proliferation, adhesiveness, invasiveness and PI3K p110α downstream cellular signaling. For this purpose, we performed the gene silencing of PIK3CA, that gene encodes the PI3K catalytic subunit p110α. Anoikis-resistant endothelial cells (Adh1-EC) subjected to PIK3CA gene silencing originated the cell lines miR-PIK3CA-Adh1-EC 1 e miR-PIK3CA-Adh1-EC 2. Those cell lines shown a reversal in characteristics associated with malignancy: decrease in anoikis resistance and cell proliferation rate, increase in apoptosis rate and caspases 3, 7, 8 activity, increased fibronectin adhesiveness, however, collagen IV and laminin adhesion rates were not altered. This was accompanied by a decrease in invasive capacity, reduction in gene and protein expression of Akt (phosphorylated on threonine 308 and serine 473), mTOR (phosphorylated on serine 2448), PTEN and H-Ras. A reduction in ERK gene expression was also observed, but this reduction xxi was not reflected in the ERK1/2 protein levels phosphorylated on the residues threonine 202 and tyrosine 204, threonine 185 and tyrosine 187. In summary, silencing of only one subunit of the PI3K family, p110α, showed good results in reversing the anoikis-resistant phenotype of endothelial cell. These results provide a molecular basis for the design of new therapies for the treatment of metastatic cancers. This strategy may help overcome apoptosis resistance in aberrantly PI3K / Akt pathway cancers.

O desenvolvimento, a diferenciação e a homeostase de células aderentes são controlados por interações célula-célula, célula-matriz extracelular (MEC) e célula-fatores solúveis. A perda destes contatos induz a um tipo específico de apoptose, o anoikis. Células tumorais adquirem a capacidade de resistir ao anoikis, sobreviver após a perda de ancoragem e viajar através do sistema vascular, podendo colonizar órgãos distantes. Este processo é denominado de metástase. A ativação da via de sinalização PI3K/Akt é o mecanismo mais comum para atingir a resistência ao anoikis em células cancerígenas. Esta via apresenta, assim, uma oportunidade e um desafio para a terapia do câncer. Estudos anteriores do nosso grupo relataram que a aquisição da resistência ao anoikis por células endoteliais de aorta de coelho desencadeou alterações morfológicas, alta taxa de proliferação, baixa adesão à fibronectina, laminina e colágeno IV, alto potencial invasivo, baixa taxa de apoptose e desregulação do ciclo celular. Além disso, as linhagens celulares resistentes ao anoikis exibem regulação positiva das vias Ras/ERK e PI3K/Akt. Isso é acompanhado por um extenso remodelamento da MEC. O papel da PI3K no câncer foi destacado pela observação de que o gene que codifica a subunidade catalítica p110α está frequentemente mutado nos cânceres humanos mais comuns. Neste estudo, buscamos elucidar o papel da proteína PI3K subunidade catalítica p110α na aquisição do fenótipo anoikis-resistente e na regulação de características celulares diretamente relacionadas à tumorigênese tais como, taxa de apoptose, proliferação celular, capacidade adesiva, capacidade invasiva e sinalização celular a jusante de PI3K p110α. Para tanto, foi efetuado o knockdown de PIK3CA, gene que codifica tal proteína. Células endoteliais resistentes ao anoikis (Adh1-EC) submetidas ao knockdown de PIK3CA originaram as linhagens celulares miR-PIK3CA-Adh1-EC 1 e miR-PIK3CA Adh1-EC 2. Essas linhagens apresentaram uma reversão nas características associadas à malignidade: diminuição na capacidade de resistência ao anoikis e da taxa de proliferação celular, aumento na taxa de apoptose e na atividade das caspases 3, 7, 8, aumento da taxa de adesão à fibronectina, no entanto as taxas de adesão ao colágeno IV e à laminina não foram alteradas. Isso foi acompanhado por xix uma diminuição na capacidade invasiva, redução na expressão gênica e proteica de Akt (fosforilada na treonina 308 e na serina 473), mTOR (fosforilada na serina 2448), PTEN e H-Ras. Foi observada também uma redução na expressão gênica de ERK, porém essa redução não se refletiu nos níveis proteicos de ERK1/2 fosforiladas nos resíduos treonina 202 e tirosina 204, treonina 185 e tirosina 187. Em resumo, o knockdown de apenas uma subunidade da família das PI3Ks, a p110α, mostrou bons resultados na reversão do fenótipo anoikis-resistente de células endoteliais. Tais resultados fornecem uma base molecular para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de cânceres metastáticos. Essa estratégia pode ajudar a superar a resistência à apoptose em cânceres com ativação aberrante da via PI3K/Akt.
Keywords Anoikis
PIK3CA
PI3K p110α
Language Portuguese
Date 2019-12-18
Research area Glicobiologia
Knowledge area Bioquimica
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 118 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=8277057
Access rights Closed access
Type Thesis
URI https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/59729

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