Clonagem, expressão e efeito antitumoral da proteína recombinante SCFV 3F12E7 ANTI-FGF2

Clonagem, expressão e efeito antitumoral da proteína recombinante SCFV 3F12E7 ANTI-FGF2

Author Costa, Bruno Andrade Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Moraes, Jane Zveiter De Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Ciências Biológicas (Biologia Molecular)
Abstract Evidence suggests that fibroblast growth factor 2 (FGF2) plays an important role in the growth of tumors and metastases. THE antiangiogenic immunotherapy, associated with cytotoxic therapies, has already shown its potential and had its use approved by the FDA (from English, Food and Drug Administration) for the treatment of some tumors. In recent work by our group, a monoclonal antibody, the anti-FGF2 mAb 3F12E7, was developed, which inhibited tumor growth and metastases in preclinical studies (Aguiar et al., 2016). Despite promising results, the IgG integral monoclonal antibody failed to inhibit the growth of already established tumors, which encouraged us to redesign new smaller agents targeting FGF2. Like this, continuing the studies of the group, in the present work, we describe a recombinant scFv antibody (single chain fragment variable) generated by union of the light and heavy chains of the IgG monoclonal antibody 3F12E7 (Pignatari et al., 2007). The advantage is that antibodies in the form of scFv, because they are smaller, infiltrate more easily into solid tumor masses (Farajnia et al., 2014; Xenaki et al., 2017). To obtain this antibody, the genes of interest were cloned into a bacterial expression vector and the variable domains of light and heavy chains were connected by a linker of 15 glycine-serine residues (Tripathi et al., 1998; Brígido et al., 2002; Molnár et al., 2003). The expression of scFv 3F12E7 anti-FGF2 was confirmed by an immunofluorescence assay performed in transfected cells. In vitro, biotin-labeled anti-FGF2 scFv 3F12E7 recognized the purified FGF2 and in B16-F10 tumor extracts. For in-house tests live, B16-F10 cells were implanted in mice (C57Bl / 6, 5x105 /animal).

Evidências sugerem que o fator 2 de crescimento de fibroblasto (FGF2) desempenha um papel importante no crescimento de tumores e em metástases. A imunoterapia antiangiogênica, associada a terapias citotóxicas, já mostrou seu potencial e teve seu uso aprovado pela FDA (do inglês, Food and Drug Administration) para o tratamento de alguns tumores. Em trabalho recente do nosso grupo, foi desenvolvido um anticorpo monoclonal, o mAb 3F12E7 anti-FGF2, que inibiu o crescimento tumoral e metástases em estudos pré-clínicos (Aguiar et al., 2016). Apesar dos resultados promissores, o anticorpo monoclonal integral IgG falhou em inibir o crescimento de tumores já estabelecidos, o que nos estimulou a redesenhar novos agentes de menor tamanho tendo como alvo o FGF2. Assim, dando continuidade aos estudos do grupo, no presente trabalho, descrevemos um anticorpo recombinante scFv (do inglês, single chain fragment variable) gerado pela união das cadeias leve e pesada do anticorpo monoclonal IgG 3F12E7 (Pignatari et al., 2007). A vantagem é que os anticorpos na forma de scFv, por serem menores, infiltram-se com mais facilidade em massas tumorais sólidas (Farajnia et al., 2014; Xenaki et al., 2017). Para a obtenção desse anticorpo, os genes de interesse foram clonados em um vetor de expressão em bactéria e os domínios variáveis das cadeias leve e pesada foram conectados por um linker de 15 resíduos de glicina-serina (Tripathi et al., 1998; Brígido et al., 2002; Molnár et al., 2003). A expressão da scFv 3F12E7 anti-FGF2 foi confirmada por ensaio de imunofluorescência realizado em células transfectadas. In vitro, a scFv 3F12E7 anti-FGF2 marcada com biotina reconheceu o FGF2 purificado e em extratos de tumor B16-F10. Para os ensaios in vivo, células B16-F10 foram implantadas em camundongos (C57Bl/6, 5x105 /animal). Os animais tratados com scFv 3F12E7 ou mAb 3F12E7 mostraram diminuição da massa tumoral de 54% e 40%, respectivamente, em relação ao controle tratado com o isotipo 1F5H2. A atividade do fragmento scFv 3F12E7 não foi significativamente maior que a do anticorpo integral mAb 3F12E7. Apesar de indicar que o efeito anti-FGF2 foi preservado com o anticorpo scFv, a alta formação de agregados observada no fragmento scFv pode ter contribuído para uma possível dificuldade de distribuição das partículas agregadas de scFv na massa tumoral. Assim, não pudemos confirmar a indicação de que uma molécula menor pudesse penetrar mais facilmente na massa tumoral e produzir resultados mais expressivos do que os obtidos com a molécula integral do anticorpo. Considerando que a scFv 3F12E7 foi capaz de inibir o crescimento de tumores subcutâneos B16-F10 dependentes da sinalização induzida por FGF2, valeria a pena investir em uma forma majoritária monomérica da scFv 3F12E7 anti-FGF2. Assim, para trabalhos futuros, temos indicações suficientes para a clonagem de uma nova scFv, visando diminuir a formação de agregados, melhorar o rendimento do refolding e, consequentemente, a bioatividade da molécula.
Keywords Single Chain Fragment Variable
Fator 2 De Crescimento De Fibroblastos
Anticorpos Monoclonais
Angiogênese Patológica
Language Portuguese
Date 2019-12-18
Research area Estrutura, Atividades E Sintese De Peptideos E Proteinas
Knowledge area Biofisica
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 92 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=8277491
Access rights Closed access
Type Thesis
URI https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/59716

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