Caracterização funcional de proteases e inibidores do carrapato rhipicephalus microplus e do parasita babesia bovis

Caracterização funcional de proteases e inibidores do carrapato rhipicephalus microplus e do parasita babesia bovis

Author Lu, Stephen Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Tanaka, Aparecida Sadae Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Ciências Biológicas (Biologia Molecular)
Abstract Objectives: Functional characterization of a subtilisin-like serine peptidase, an aspartic peptidase and a cysteine peptidase from Babesia bovis parasites and characterization of a novel type 1 cystatin inhibitor from the tick Rhipicephalus microplus. Material and methods: We searched the B. bovis genome and selected three peptidases: a subtilisin-like peptidase (XP_001610126) (BbSp), an aspartic peptidase (BBOV_IV007890) (BbAsp) and a cysteine peptidase (XP_001612131) (BbCp). The recombinant protein was obtained using different expression systems (bacteria, yeast or insect cells) and purified. The recombinant proteins were injected in rabbits or mice to produce antibodies that were used in B. bovis in vitro neutralization assays. After refolding the recombinant BbCp presented proteolytic activity and, for that reason, we carried out its biochemical characterization and substrate profiling using a peptide library in phage display. We also investigated its proteolytic activity in the presence of different inhibitors, including cystatins from R. microplus. At the same time, we cloned, expressed, purified and characterized a novel type 1 cystatin from the tick R. microplus. Results: Initially BbSp expression assays were performed in bacteria, yeast and insect cells, however, the recombinant protein was not detected in the condition tested. Therefore, a predicted immunogenic N-terminal region of BbSp was selected and expressed in bacteria. Antibodies anti-BbSp N-terminal region impaired B. bovis growth in vitro and a reduction of 32% in infected cells was observed. Simultaneously, recombinant BbAsp was produced using insect cell expression system and antibodies anti-BbAsp reduced the parasitemia in 61% compared to the control groups. Finally, recombinant BbCp was obtained in bacterial inclusion bodies and became soluble only in the presence of urea 8M. After purification recombinant BbCp present itself as a 37 kDa protein band and after refolding as a 25 kDa protein band. As other cysteine peptidases, BbCp proteolytic activity was enhanced in the presence of a reducing agent (DTT), had an optimum pH between 6.5 – 7.0, had preference for Ser>Pro>Val>Leu>Phe at P2 position and was completely inhibited by E64. Moreover BbCp was also inhibited by R. microplus cystatins, such as Bmcystatin-1 (Ki = 2.89 nM) and Rmcystatin-3 (Ki = 0,13 nM). Antibodies anti-BbCp impaired B. bovis growth in vitro xxi and a reduction of 32% of infected cells was observed. In collaboration with the Instituto de Pesquisas Veterinárias Desidério we analyzed the modulation of 4 cystatin genes in the midgut of R. microplus infected with B. bovis and the cystatins Bmcystatin-1, Rmcystatin-1b and Rmcystatin-3 appeared to be modulated. Rmcystatin-1b transcripts were mainly found in the midgut of partially (65 times higher in relation to salivary glands) and fully (40 times higher in relation to hemocytes) fed R. microplus females. Moreover, Rmcystatin-1b transcripts were found down-modulated during the first three days post-detachment. The recombinant inhibitor was obtained in bacteria and presented inhibitory activity towards several cysteine peptidases, such as BmCL-1 (Ki = 0.013 nM), papain (Ki = 0.72 nM), human cathepsin L (Ki = 0.41 nM), human cathepsin B (Ki = 0.27 nM) and recombinant BbCp (Ki = 7,48 nM). Rmcystatin-1b was also able to partially inhibit proteolytic activity of R. microplus midgut extracts 48 hours postdetachment. Moreover, the recombinant inhibitor also impaired B. bovis growth in vitro and a reduction of 50% was observed 72 hours post-treatment. Conclusion: Despite the several conditions tested we were unable to obtain an active recombinant BbSp and BbAsp. Meanwhile, recombinant BbCp displayed typical cysteine peptidase kinetic features. The neutralization assays carried out with antibodies against the selected peptidases suggest their possible role during parasite invasion/egress of bovine erythrocytes. Rmcystatin-1b was mainly localized in tick midgut and the severe down-modulation during the first days post-detachment together with its ability to inhibit native cysteine peptidase from R. microplus midgut suggest its role as a possible regulator of R. microplus digestion. Moreover, since the recombinant inhibitor was able to inhibit B. bovis cysteine peptidase and interfered with parasite growth in vitro, we speculate that interplay between B. bovis peptidase and R. microplus inhibitors may contribute to parasite control and survival in the tick.

Objetivo: Caracterizar uma serino peptidase semelhante à subtilisina, uma aspartil e uma cisteíno peptidase do parasita Babesia bovis, além de um novo inibidor do tipo cistatina do carrapato R. microplus. Materiais e métodos: Realizamos uma busca no genoma de B. bovis e selecionamos três peptidases para este estudo: uma serino peptidase semelhante à subtilisina (XP_001610126) (BbSp), uma aspartil peptidase (BBOV_IV007890) (BbAsp) e uma cisteíno peptidase (XP_001612131) (BbCp). As proteases recombinantes foram obtidas utilizando diferentes sistemas de expressão (bactérias, leveduras ou células de insetos) e purificadas. Os anticorpos produzidos em coelhos ou camundongos foram utilizados em ensaios de neutralização do crescimento de B. bovis in vitro. Após ensaios de refolding a BbCp foi obtida de forma ativa e, portanto, determinamos sua específicidade com o uso de uma biblioteca de peptídeos em phage display, além de avaliar sua atividade proteolítica na presença de diferentes cistatinas de R. microplus. Em paralelo, realizamos a clonagem, expressão e purificação de uma nova cistatina do tipo 1 de R. microplus. Resultados: Inicialmente foram realizados testes de expressão da BbSp em diferentes sistemas (bactérias, leveduras e células de inseto), sem sucesso. Desta forma uma porção da região N-terminal, predita potencialmente imunogênica, foi selecionada e obtida em bactérias. O soro contendo anticorpos contra a porção N-terminal da BbSp foi capaz de interferir no crescimento de B. bovis in vitro, com redução de 32% da parasitemia na cultura quando comparada ao grupo controle. Em paralelo, a BbAsp recombinante foi obtida utilizando o sistema de expressão de células de inseto. O tratamento de culturas de B. bovis com anticorpos anti-BbAsp resultou em redução de 61% da parasitemia. A enzima BbCp foi obtida nos corpos de inclusão de bactérias, sendo solubilizada na presença de ureia 8 M. A BbCp recombinante purificada se apresentou como uma banda proteíca de 37 kDa e, após o refolding, como uma banda de 25 kDa. Como outras cisteíno peptidase, a rBbCp apresentou pH ótimo entre 6,5 – 7,0, aumento da atividade proteolítica na presença de um agente redutor (30 vezes com DTT 1 mM), preferência pelos resíduos Ser>Pro>Val>Leu>Phe na posição P2 e foi completamente inibida na presença de E64. Além disso, a BbCp recombinante também foi inibida por cistatinas do R. microplus, como a Bmcystatin-1 (Ki = 2,89 nM) e a Rmcystatin-3 (Ki = 0,13 nM). Anticorpos anti-BbCp também foram capazes de interferir no crescimento de B. bovis in vitro e observamos redução de 32% de células infectadas em relação ao grupo controle. R. microplus de campo apresentaram modulação da expressão de 3 cistatinas (Bmcystatin-1, Rmcystatin-1b e Rmcystatin-4) no intestino dos animais infectados por B. bovis. xix Os transcritos da Rmcystatin-1b foram encontrados no intestino de carrapatos parcialmente (65 vezes maior em relação as glândulas salivares) ou completamente alimentados (40 vezes maior em relação aos hemócitos), sendo modulados negativamente durante os 3 primeiros dias após a queda. O inibidor recombinante foi obtido em bactérias e após sua purificação apresentou atividade inibitória contra diferentes cisteíno peptidases, como BmCL-1 (Ki = 0,013 nM), papaína (Ki = 0,72 nM), catepsina L humana (Ki = 0,41 nM), catepsina B humana (Ki = 6,27 nM) e rBbCp (Ki = 7,48 nM). O inibidor recombinante também inibiu parcialmente a atividade proteolítica presente no intestino de R. microplus 48 h pós-queda, além de interferir no crescimento de B. bovis in vitro, reduzindo em aproximadamente 50% a parasitemia quando comparado ao controle. Conclusão: Apesar das diferentes condições testadas, não foi possível obter a BbSp e a BbAsp ativas. Por outro lado, a BbCp recombinante apresentou propriedades cinéticas comuns às cisteíno peptidases. Os ensaios de neutralização de B. bovis, utilizando soro contra as peptidases de interesse, sugerem seu possível envolvimento durante a invasão ou egresso de eritrócitos bovinos. Os resultados da Rmcystatin-1b cuja localização encontra-se majoritária no intestino de carrapatos somados a sua modulação durante os primeiros dias pós-queda e a sua capacidade de inibir cisteíno peptidases nativas do R. microplus sugerem seu possível papel como um regulador da digestão em carrapatos. A Rmcystatin-1b também apresentou atividade inibitória contra a BbCp, além de interferir no crescimento de B. bovis in vitro. Com base nesses resultados especulamos que a interação das peptidases de B. bovis com os inibidores de R. microplus deve contribuir para a interação parasita-hospedeiro.
Keywords B. Bovis
R. Microplus
Inibidores
Proteases
B. Bovis
R. Microplus
Inibidores
Proteases
Language Portuguese
Date 2019-08-29
Research area Estrutura, Atividades E Sintese De Peptideos E Proteinas
Knowledge area Biofisica
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 95 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=7724153
Access rights Closed access
Type Thesis
URI https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/59677

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