Polissacarídeos Sulfatados Contaminantes De Preparações De Heparinas Cruas E Produto Final: Caracterização Estrutural E Farmacológica

Polissacarídeos Sulfatados Contaminantes De Preparações De Heparinas Cruas E Produto Final: Caracterização Estrutural E Farmacológica

Author Mendes, Aline Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Nader, Helena Bonciani Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Ciências Biológicas (Biologia Molecular)
Abstract Heparin is a glycosaminoglycan present in animal tissues and performs a variety of biological and pharmacological functions related to peculiar structural features. It is an essential anticoagulant in surgeries and in the treatment and prevention of thrombosis and other coagulation disorders. The structure of heparin consists of a linear, highly sulfated polysaccharide of repetitive α-L-iduronic acid or β-D-glucuronic acid disaccharide units attached to α-D-glucosamine by α-1,4-type bonds. It presents sulfation in C2 of L-iduronic acid (70-90%), being rarely sulfated in D-glucuronic acid. Glucosamine is usually sulfated at the N- and C6 positions. The intradisacharid bonds are of type α-1,4 for iduronic acid and β-1,4 for glucuronic acid. The anticoagulant effect of heparin is mediated, mainly by interaction with antithrombin (AT), potentiating the inhibition of serine proteases of the coagulation cascade. Heparin is isolated from bovine or porcine intestinal mucosa and because it is a natural product, contaminants may be present, compromising quality control. In 2008, adverse effects associated with the presence of an oversulfated chondroitin sulfate (OSCS) were observed in the preparations of porcine heparin, which led to the death of patients, causing a global public health crisis. However, it has not been clarified whether OSCS has been added to the purified heparin preparation, or whether it has already been introduced during the production of the raw heparin. Thus commercial raw heparin preparations from the Techpool Company (Guangdong, China) and final product from Changzhou SPL Company (Jiangsu, China), both extracted from porcine intestinal mucosa, were analyzed for the presence of sulfate contaminants. The influence of these potential contaminants on heparin quality control methods as well as pharmacological effects were investigated. The results of electrophoresis, enzymatic degradation and scanning in the UV spectrum showed that contaminants are present in both raw heparin and final product samples and that, therefore, adulteration of heparin occurred at the beginning of its production. The purified contaminants were analyzed by NMR and characterized as OSCS and a compound with distinct sulfation pattern. These isolated compounds inhibited the formation of heparinase products and were resistant to degradation with chondroitinase AC and ABC under exhaustive conditions. Pharmacological assays of anti-FXa and anti-IIa activity have shown that the presence of contaminant promotes a greater inhibition of Factor IIa, whereas the effect on factor Xa remains similar to that obtained with standard heparin. Contaminated heparins increase the time of clot formation in the aPTT and PT assays. No cytotoxic effect of these compounds was observed on endothelial cells. The ovsersulfated chondroitin sulfates isolated in this work bind to the same heparin binding sites on endothelial cells. This set of data once again shows that depending on the structural complexity of heparin, the quality control of the production must be performed by a set of methods based on different properties, since the sulfated contaminants are co-purified with heparin.

A heparina é um glicosaminoglicano presente em tecidos de animais e que desempenha uma variedade de funções biológicas e farmacológicas relacionadas a características estruturais peculiares. É um anticoagulante essencial em cirurgias e no tratamento e prevenção de doenças tromboembolíticas e distúrbios da coagulação. A estrutura da heparina consiste em um polissacarídeo linear, altamente sulfatado de unidades dissacarídicas repetitivas de ácido α-L-idurônico ou β-D-glucurônico ligados à α-D-glucosamina por ligações do tipo α-1,4. Apresenta sulfatação no C2 do ácido L-idurônico (70-90%), sendo raramente sulfatada no ácido D-glucurônico. A glucosamina é usualmente sulfatada nas posições N- e C6. As ligações intradissacarídicas são do tipo -1,4 para o ácido idurônico e -1,4 para o ácido glucurônico. O efeito anticoagulante da heparina é mediado, principalmente pela interação com a antitrombina (AT), potencializando a inibição das serinoproteases da cascata da coagulação. A heparina é isolada da mucosa intestinal bovina ou suína e por ser um produto natural, contaminantes podem estar presentes, comprometendo o controle de qualidade. Em 2008, foram observados efeitos adversos, associados à presença de um condroitim sulfato supersulfatado (OSCS), nas preparações de heparina suína, que levaram à morte de pacientes, causando uma crise mundial de saúde pública com o recolhimento de lotes de heparina. No entanto, não foi esclarecido se o OSCS foi adicionado à preparação de heparina purificada, ou se o mesmo foi introduzido já durante a produção da heparina crua. Assim, neste trabalho, preparações comerciais de heparinas cruas da Techpool Company (Guangdong, China) e produto final, da Changzhou SPL Company (Jiangsu, China), ambas extraídas de mucosa intestinal suína, foram analisadas quanto à presença de contaminantes sulfatados. A influência desses potenciais contaminantes nos métodos de controle de qualidade de heparina, bem como nos efeitos farmacológicos foram investigados. Os resultados de eletroforese, degradação enzimática e varredura no espectro UV mostraram que os contaminantes estão presentes tanto em amostras de heparina crua quanto de produto final e que, portanto, a adulteração da heparina ocorreu no início de sua produção. Os contaminantes purificados foram analisados por RMN e caracterizados como OSCS e um composto com padrão de sulfatação distinto. Esses compostos isolados inibiram a formação de produtos da heparinase e foram resistentes à degradação com as condroitinases AC e ABC em condições exaustivas. Os ensaios farmacológicos de atividade anti-FXa e anti-IIa mostraram que a presença de contaminante promove uma maior inibição do Fator IIa, enquanto que o efeito sobre o fator Xa permaneceu semelhante ao obtido com a heparina padrão. As heparinas contaminadas aumentam o tempo de formação do coágulo nos ensaios de TTPa e TP.Não foi observado efeito citotóxico desses compostos nas células endoteliais. Os condroitim supersulfatados isolados neste trabalho ligam-se aos mesmos sítios de ligação da heparina em células endoteliais. Esse conjunto de dados evidencia mais uma vez que em função da complexidade estrutural da heparina, o controle de qualidade da produção deve obrigatoriamente ser realizado por um conjunto de métodos baseados em diferentes propriedades, uma vez que os contaminantes sulfatados são co-purificados com a heparina.
Keywords Heparin
Chondrocyte Sulfate Sulphate
Relationship Structuring
Quality Control
Heparina
Condroitim Sulfato Supersulfatado
Relação Estruturaatividade
Controle De Qualidade
Language Portuguese
Date 2017-09-28
Research area Glicobiologia
Knowledge area Biologia Molecular E Celular
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 150p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=5064819
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50532

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