Mutantes Do Receptor B2 De Cininas: Análise Da Interação Droga-Receptor E Sua Apllcabilldade No Estudo Do Angioedema Heredit Ário

Mutantes Do Receptor B2 De Cininas: Análise Da Interação Droga-Receptor E Sua Apllcabilldade No Estudo Do Angioedema Heredit Ário

Author Silva, Rafael Filippelli Da Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Pesquero, Joao Bosco Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Ciências Biológicas (Biologia Molecular)
Abstract Introduction: bradykinin (8K) is an important pressure regulating peptide arterial, nociception, inflammation and is associated with the pathophysiology of angioedema (HAE). The main clinical aspects of HAE are mediated by 8K, which exercise by the activation of receptor 82 (82R), a member of the family of G protein coupled receptors (GPCR). The objective of the present study was to evaluate if 82R mutations found in HAE patients could alter the profile pharmacological effect of 8K signal transduction, leading to relevant for the pathophysiology of the disease. Materials and methods: we use G-and-3-arrestin biosensors to perform 8RET analyzes and evaluate functional profiles of mutant 82Rs. All the experiments were carried out in transiently transfected HEK 293T cells, either with the wild-type or with the human 82R mutants. Competitive binding assays using 8K radiolabeled (3H-8K) were performed to estimate the 8K affinity for mutant receptors. The 8RET assays, used to evaluate the activation of G protein and the recruitment of β-arrestin 1 and 2, were performed using a method adapted from that described by Quoyer et al. (2013). Results: the binding assays showed that 8K retains a similar affinity at mutant receptors R14C, W344C, G354E and V376M, when compared to the wild-type receptor. In analysis, 8K triggered the coupling of G protein and mobilization intracellular calcium with similar potency and efficacy at R14C and G354E compared to WT. On the other hand, these receptors were not able to to recruit! 3-arrestinas. In the W344C and V376M mutants, the potency and efficacy of 8K was reduced on activation of all of the signaling pathways tested. Conclusions: These findings provide strong evidence for a biased agonist profile endogenous 8K G protein by activating mutants R14C and G354E 82R identified in patients with HAE. On the other hand, mutants W344C and V376M showed a decrease in the pharmacological responses induced by 8K. We believe that the current data contribute to revealing the mechanisms molecules involved in HAE and thus opening up new perspectives and approaches to study and treat this disease.

Introdução: a bradicinina (8K) é um importante peptídeo regulador da pressão arterial, nocicepção, inflamação e é associada com a fisiopatologia do angioedema hereditário (AEH). Os principais aspectos clínicos do AEH são mediados pela 8K, que exerce suas ações pela ativação do receptor 82 (82R), um membro da família de receptores acoplados à proteína G (GPCR). O objetivo do presente trabalho foi avaliar se mutações do 82R encontradas em pacientes com AEH poderiam alterar o perfil farmacológico de transdução de sinal da 8K, levando a consequências relevantes para a fisiopatologia da doença. Materiais e métodos: utilizamos construções de biossensores de proteína G e !3-arrestinas para realizar análises de 8RET e avaliar perfis funcionais dos 82R mutantes. Todos os experimentos foram realizados em células HEK 293T transientemente transfectadas, quer com o receptor selvagem ou com os mutantes do 82R humano. Os ensaios de ligação competitiva utilizando 8K radiomarcada (3H-8K) foram realizados para estimar a afinidade de 8K para receptores mutantes. Os ensaios de 8RET, utilizados para avaliar a ativação da proteína G e o recrutamento de !3-arrestina1 e 2, foram realizados usando um método adaptado do descrito por Quoyer et aI. (2013). Resultados: os ensaios de ligação mostraram que a 8K mantém uma afinidade semelhante nos receptores mutantes R14C, W344C, G354E e V376M, quando comparados ao receptor selvagem. Em análises funcionais, o 8K desencadeou o acoplamento da proteína G e mobilização de cálcio intracelular com potências e eficácias similares nos receptores R14C e G354E em comparação com o WT. Por outro lado, esse receptores não foram capazes de recrutar !3-arrestinas. Já nos mutantes W344C e V376M, a potência e a eficácia da 8K foi reduzida na ativação de todas as vias de sinalização testadas. Conclusões: Esses achados fornecem evidências fortes para um perfil de agonismo tendencioso de proteína G de 8K endógena ao ativar mutantes os mutantes R14C e G354E do 82R identificados em pacientes com AEH. Por outro lado, os mutantes W344C e V376M apresentaram uma diminuição das respostas farmacológicas induzidas pela 8K. Acreditamos que os dados atuais contribuem para revelar os mecanismos moleculares envolvidos no AEH e, portanto, abrindo novas perspectivas e abordagens para estudo e tratamento desta doença.
Keywords Hereditary Angioedema
Bradykinin
Receiver B
Mutants
Biased Aqonismo
Angioedema Hereditário
Bradicinina
Receptor B
Mutantes
Aqonismo Tendencioso
Language Portuguese
Date 2017-12-13
Research area Estrutura, Atividades E Sintese De Peptideos E Proteinas
Knowledge area Biofisica
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 145p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=5170326
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50524

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