Papel Do Gene C1Orf24 No Desenvolvimento Das Neoplasias Da Tiroide E Investigação Dos Micrornas Na Regulação Da Sua Expressão

Papel Do Gene C1Orf24 No Desenvolvimento Das Neoplasias Da Tiroide E Investigação Dos Micrornas Na Regulação Da Sua Expressão

Author Nozima, Bruno Heidi Nakano Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Cerutti, Janete Maria Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Biologia estrutural e funcional
Abstract Our group previously demonstrated that C1orf24 gene expression was increased in several subtypes of thyroid cancer. By immunohistochemistry, C1orf24 and three other proteins expression were able to distinguish benign from malignant thyroid lesions with high sensitivity and specificity, becoming an important biomarker in preoperative diagnosis of thyroid nodules. However, little is known about C1orf24 role in the pathogenesis and/or progression of thyroid nodules. Initially, this study aimed to identify the mechanism of C1orf24 expression and verify the effects of its deregulation in thyroid cells model. We identified the microRNA-106b as a potential regulator of C1orf24 expression, in silico. Then, we confirmed the low expression profile of microRNA-106b in thyroid carcinomas, corroborating the inverse correlation of C1orf24 and microRNA-106b expression. Direct interaction of microRNA-106b and C1orf24 was demonstrated by cloning the 3’-UTR region of C1orf24 mRNA in a luciferase gene followed by co-transfection with microRNA-106b precursor and identifying lower luciferase activity then in control cells. Finally, C1orf24 inhibition by microRNA-106b resulted in apoptosis increase and decrease in cell migration. The second step of this study was to identify the role of C1orf24 in the pathogenesis of thyroid. C1orf24 was initially described as over expressed in hereditary renal carcinomas with inactivating mutation in the Tsc2 gene, main regulators of mTOR. It was suggested that C1orf24 integrates the mTOR/S6K1 pathway and ER stress in order to protect from cells from death under stress conditions. Thus, we investigated C1orf24 role in autophagy. Starvation of normal thyroid cells PCCL3 induced both C1orf24 expression and LC3-II conversion, a hallmark of autophagy. Starvation also inhibited AKT/p70S6K1 pathway and induced ERK phosphorylation. The role of C1orf24 in autophagy was investigated by transmission electron microscopy, in PCCL3 cells over expressing C1orf24 and by mCherry-EGFP-LC3B and C1orf24 co- expression by confocal microscopy. We observed that C1orf24 expression induced both autophagic vesicles and autophagosomes in PCCL3 cells. To confirm the effects of C1orf24 on autophagy, a second thyroid cell model was used. TPC1 was originated from a papillary thyroid carcinoma and presented high expression of C1orf24. Inhibition of C1orf24 by siRNAs also induced autophagy, verified by LC3-II conversion. TPC1 expressing mCherry-EGFP-LC3B and C1orf24 silenced showed increased autophagosome and autolysosome formation. Phosphorylation of mTOR was decreased and MAPK was activated. Despite of the opposite results, these data suggested that C1orf24 role on autophagy could cell-context dependent. Therefore, we evaluated if RET/PTC1 fusion present in TPC1 cells would affect C1orf24 regulation of autophagy. In PCCL3 cells, C1orf24 inhibited RET/PTC1-induced autophagy. Together, our data suggest that C1orf24 has distinct roles on autophagy. MAPK modulations by oncogenes has important part in C1orf24 effects on autophagy.

Estudos anteriores do nosso grupo mostraram que a expressão do gene C1orf24 (Chromosome 1 Open Reading Frame 24) encontra-se aumentada nos diversos subtipos de carcinomas da tiroide. A validação por imunohistoquimica demonstrou que C1orf24, em conjunto com outros três genes, foi capaz de distinguir lesões benignas das malignas com alta sensibilidade e especificidade, o que o torna importante marcador a ser utilizado no diagnóstico pré-operatório dos nódulos da tiroide. Apesar da relevância como marcadores de diagnóstico, pouco se sabe sobre as funções destas proteínas na patogênese e/ou progressão dos tumores da tiroide. Este estudo teve como objetivo inicial identificar o mecanismo de regulação do gene C1orf24 e verificar os efeitos da sua desregulação em modelo de células tiroideanas. Em estudo in silico, identificamos o microRNA-106b como um potencial regulador da expressão de C1orf24. Além disso, verificamos a baixa expressão deste microRNA em amostras de carcinoma de tiroide quando comparados aos adenomas, reforçando a correlação inversa entre o microRNA-106b e C1orf24. Demonstramos a interação direta entre miR-106b e C1orf24 ao clonar o sítio de ligação do mRNA de C1orf24 na porção 3’ do gene da luciferase, co-transfectar com o precursor de miR-106b e observar uma redução da atividade da luciferase em relação aos controles. Por fim, a inibição da expressão de C1orf24 por miR-106b resultou em aumento na morte celular das células de carcinomas da tiroide e redução na migração celular. A segunda etapa do estudo consistiu em elucidar o papel de C1orf24 na patogênese dos tumores da tiroide. C1orf24 foi inicialmente descrito super expresso em modelos de carcinoma renal hereditário com mutações inativadoras no gene Tsc2, principal regulador da via de crescimento mTOR. Foi sugerido que C1orf24 integra a via mTOR/S6K1 com estresse de retículo endoplasmático protejendo a célula da morte celular em condições de estresse. Assim, investigamos a participação de C1orf24 na autofagia. A depleção de nutrientes em células de tiroide normal PCCL3 foi capaz de induzir a expressão de C1orf24 e de LC3-II, principal marcador da autofagia. A falta de nutrients inibiu a via AKT/p70S6K1, concominate ao aumento da fosforilação de ERK. O papel de C1orf24 na autofagia foi investigado nas células PCCL3 com super expressão de C1orf24 por microscopia eletrônica de transmissão, bem como, pela co-expressão de C1orf24 e vetor de expressão mCherry-EGFP-LC3B e análise por microscopia confocal. Observamos que a expresssão de C1orf24 promoveu um aumento no número de vesículas autofágicas nas células PCCL3, bem como induziu a formação de autofagossomos. Para comprovar os efeitos de C1orf24 na autofagia, utilizamos uma linhagem celular de carcinoma papilífero da tiroide (TPC1), que apresentava um aumento da expressão de C1orf24. Verificamos alta expressão basal de C1orf24 que, após silenciado por siRNAs, também induziu a expressão de LC3-II e, portanto, a autofagia. Da mesma forma, células TPC1 transfectadas com o vetor de expressão de mCherry-EGFP-LC3B e silenciadas para C1orf24 apresentaram um aumento na formação de autofagossomos e autolisossomos. A ativação da via mTOR foi inibida e da MAPK aumentada. Apesar destes dados parecerem contraditórios, sugeriam que o efeito de C1orf24 poderia ser dependente do contexto celular. Assim, avaliamos se a fusão RET/PTC1, presente nas células TPC1, alterariam os efeitos de C1orf24 na autofagia. Na presença do oncogene RET/PTC1, C1orf24 inibiu a autofagia nas células PCCL3. Em conjunto, nossos dados indicam que C1orf24 possui efeitos distintos na autofagia. Em células tiroideanas normais, C1orf24 induz a autofagia porém, nas células malignas, C1orf24 inibe-a. Modulações da via MAPK em resposta à presença de oncogenes possuem papel importante na atuação de C1orf24 na autofagia.
Keywords Neoplasms Of The Thyroid Gland
Micrornas
Autophagy
Neoplasias Da Glândula Tireoide
Micrornas
Autofagia
Language Portuguese
Date 2017-10-31
Research area Genética E Epigenética Do Câncer
Knowledge area Genética
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 256p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=5678124
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50204

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