Investigação Dos Genes Drivers Ptch1, Ctnnb1, Ddx3X, Tert E Tp53, E A Relevância Prognóstica De Tp53 No Meduloblastoma Da Infância E Adolescência: Da Biologia Molecular À Clínica

Investigação Dos Genes Drivers Ptch1, Ctnnb1, Ddx3X, Tert E Tp53, E A Relevância Prognóstica De Tp53 No Meduloblastoma Da Infância E Adolescência: Da Biologia Molecular À Clínica

Author Cordeiro, Bruna Mascaro Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Toledo, Silvia Regina Caminada De Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Biologia estrutural e funcional
Abstract Medulloblastoma (MB) is an embryonic cerebellar neuroepithelial tumor, and one of the most frequent brain tumor in childhood and adolescence. The new MB classification is based on biological aspects, mainly molecular, that requires a therapeutic management respecting this knowledge. In the present work, we established a panel for genomic identification of variants in genes known to be important for MB tumorigenesis. In addition, we investigated the cellular and molecular behavior of MB cell lines exposed to treatment with valproic acid (VA), a histone deacetylase inhibitor (HDACi), alone and combined with cisplatin (CDDP). For genomic variants identification, next generation sequencing (NGS) was performed in 28 tumor samples and three MB cell lines (DAOY, D283MED and ONS-76). All identified variants were validated through IGV software (http://www.broadinstitute.org/igv/), and compared to the databases: dbSNP, 1000 genomes, COSMIC and ExAC. The impact of the variants was investigated using the predictors: SIFT, PolyPhen, and Mutation Taster. Mutations and variants of uncertain significance (VUS) were observed in all genes investigated by NGS in an average of 15 variants/sample. PTCH1 gene had the highest number of variants/samples. CTNNB1 gene showed two mutations in exon 3, already described for MB. DDX3X gene showed only two mutations, classified as pathogenic. TERT and TP53 genes presented seven and six exonic variants, respectively, and for TP53 gene, we observed the presence of a polymorphism (c.C215G: pP72R) in 74% of the samples. All the four samples harboring TP53 mutations showed concomitantly PTCH1 mutations. Disease progression observed in patients with these concomitant mutations corroborates to the recent risk stratification proposed. MB cell lines used in this study were certified by STR (Short Tandem Repeat), using the GlobalFiler® PCR Amplification Kit (Applied Biosystems™/ThermoFisher Scientific®), presenting a correspondence indexes (CI) greater than 90%. Cell lines were submitted to three treatment regimen: single VA, single CDDP, and VA and CDDP combined. After treatment, cells were evaluated for viability, cytotoxicity, migration and invasion. Expression of genes related to the tumorigenic process of MB by qRT-PCR was also performed, and methylation and acetylation profile of these cells was analyzed by Western Blott. In DAOY cell line, only treatment with CDDP was significantly effective in reducing of cell viability (p<0.0001). For D283MED and ONS-76 cell lines, combined treatment was more effective in reducing viability (p<0.0001). D283MED and ONS-76 cell lines do not present TP53 gene mutation, which should directly interfere with teatment response. The expression levels of AKT, GLI1 and TERT genes were significantly increased in single or combined VA treatment, for D283MED and ONS-76 cells, (p<0.0001) when compared to the other treatment groups. In the present study, we observed: 1) in MB cell lines the presence of TP53 mutation is an important factor in treatment response; 2) VA does not contribute to the induction of cell death in cells where TP53 gene is mutated; 3) cells that survive to VA treatment have an increased proliferative potential; 4) and central genes in the pathways involved in MB tumorigenesis process, present significant overexpression when exposed to VA treatment. VA treatment should be considered with attention in MB patients. The investigation of TP53 gene mutation should be performed for patients with MB to ensure correct risk stratification. The frequency and distribution of the mutations described in driver genes in MB, deserve further investigation in MB samples.

O Meduloblastoma (MB) é um tumor embrionário neuroepitelial do cerebelo, e um dos tumores cerebrais mais frequentes da infância e adolescência. A nova classificação é centrada nos aspectos biológicos, principalmente moleculares, que requerem um manejo terapêutico que respeite esses novos conhecimentos. No presente trabalho, estabelecemos um painel para a identificação de variantes genômicas em genes sabidamente importantes para a tumorigênese do MB. Além disso, foi investigado o comportamento celular e molecular de linhagens celulares de MB expostas ao tratamento com ácido valpróico (AV), um inibidor de desacetilases de histonas (HDACi), sozinho e combinado à cisplatina (CDDP), uma das drogas centrais no tratamento do MB. Para a identificação das variantes genômicas foi utilizada a metodologia de sequenciamento de nova geração (NGS) em 28 amostras tumorais e três linhagens celulares de MB (DAOY, D283MED e ONS-76). Todas as variantes identificadas foram validadas através do software IGV (http://www.broadinstitute.org/igv/), e comparadas com os bancos de dados: dbSNP, 1000 genomes, COSMIC e ExAC. O impacto das variantes foi investigado utilizando os preditores: SIFT, PolyPhen, e Mutation Taster. Foram observadas mutações e variantes de significado incerto (VUS) em uma média de 15 variantes/amostra, em todos os genes investigados por NGS. O gene PTCH1 apresentou o maior número de variantes/amostra. O gene CTNNB1 apresentou duas mutações no éxon 3, já descritas para o MB. O gene DDX3X apresentou apenas duas mutações classificadas como patogênicas. Os genes TERT e TP53 apresentaram sete e seis variantes exônicas, respectivamente, e para o gene TP53, observamos a presença de um polimorfismo (c.C215G:pP72R) em 74% das amostras. As quatro amostras portadoras de mutações em TP53, apresentaram concomitantemente mutações de PTCH1. A progressão de doença observada nos pacientes portadores dessas mutações concomitantes, corrobora com a recente estratificação de risco proposta. As três linhagens celulares de MB utilizadas neste estudo foram autenticadas por STR (Short Tandem Repeat), utilizando o kit de identificação GlobalFiler® PCR Amplification Kit (Applied Biosystems™/ThermoFisher Scientific®), apresentando índice de correspondência (IC) maior de 90%. As linhagens celulares foram submetidas a três regimes de tratamento: apenas com AV, apenas com CDDP, e AV e CDDP combinados. Após tratadas, as células foram avaliadas quanto a viabilidade, citotoxicidade, migração e invasão. Também foi realizada a investigação da expressão de genes relacionados ao processo tumorigênico do MB, por qRT-PCR, e analisado o perfil de metilação e acetilação, por Western Blott, nesses grupos de células. Na linhagem DAOY, o tratamento com CDDP foi o único significantemente eficaz em reduzir a viabilidade celular (p<0,0001). Já para as linhagens D283MED e ONS-76, o tratamento combinado foi mais eficaz em reduzir a viabilidade (p<0,0001). Devemos ressaltar que as linhagens D283MED e ONS-76, não apresentam mutação em TP53, o que deve interferir na resposta ao tratamento. Os níveis de expressão dos genes AKT, GLI1 e TERT, nas linhagens D283MED e ONS-76 tratadas com AV, isolado ou combinado, estavam significantemente aumentados (p<0.0001) quando comparados com os outros grupos de tratamento. No presente estudo observamos, que em linhagens celulares representativas de MB, a presença de mutação de TP53 é fator importante na resposta ao tratamento; o AV não colabora com a indução de morte celular nas células onde o gene TP53 está mutado; as células que sobrevivem ao tratamento com AV tem um potencial proliferativo aumentado e, genes centrais nas vias envolvidas com o processo de tumorigênese do MB, apresentam expressão significantemente maior do que o controle após tratamento com AV, evidenciando que o tratamento com AV deve ser considerado com atenção em pacientes com MB; a investigação de mutação do gene TP53 deve ser realizada para os pacientes com MB, para garantir a correta estratificação de risco; a frequência e a distribuição das mutações descritas em genes drivers no MB, merecem mais investigações em amostras de MB.
Keywords Medulloblastoma
Ngs
Mutation
Polymorphism
Tp53
Hdaci
Va
Meduloblastoma
Ngs
Mutações
Polimorfismos
Tp53
Hdaci
Av
Language Portuguese
Date 2017-06-29
Research area Genética E Epigenética Do Câncer
Knowledge area Genética
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 59p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=5053038
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50200

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