Análise Comparativa Da Atividade Antitumoral De Compostos Ciclopaladados Em Melanomas

Análise Comparativa Da Atividade Antitumoral De Compostos Ciclopaladados Em Melanomas

Author Garcia, Daniel Moreno Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Trindade, Claudia Bincoletto Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Farmacologia
Abstract Objective: To analyze and compare the molecular mechanisms involved in the cytotoxic activity of the palladium complexes BPC1.1 and BPC1.2 against wild-type and BRAF-mutated human and mouse metastatic melanoma cell lines. Methods: The cell models selected for initial cell viability studies were B16F10-Nex2 mouse melanoma, and CHL-1, A375, Skmel-110, Skmel-05 and A20158 human melanoma cell lines. These assays were carried out using a common MTT reduction protocol. A2058 and Skmel-110 cells were then subjected to cell death analysis by flow cytometry with propidium iodide staining. Analysis of reactive oxygen species generation, changes in mitochondrial membrane potential, quantification of acidic vesicles, lysosomal pH alterations, and levels of intracellular Ca2+, caspase-8, caspase-3 cytochrome c, cathepsins B and L, bax and bid were carried out in A2058 cells. Results: Both complexes were shown to be cytotoxic towards all assayed cell lines following 24h of exposure (IC50 values between 3,5 and 20 μM). A2058 and Skmel-110 human melanoma cell lines were selected for further tests. Cell death analysis with propidium iodide staining showed that exposure to the BPC complexes for 24h caused a significant increase in the sub-G1 cell population for both cell lines. However, after only 6h of treatment, only BPC1.2 was effective. The A2058 cell line was shown to be more sensitive to the treatments, and was therefore selected for subsequent assays. Flow cytometry analysis with annexin V-FITC/PI staining showed that the BPC complexes induce cell death by different pathways, involving a time-dependent increase in ROS production (intensified after 4h of treatment); loss of mitochondrial membrane potential (observed after 1h incubation, and intensified after 6h of exposure); and a significant increase in acidic compartments after 6h (for BPC1.1) as observed by AO staining. Changes in lysosomal pH were observed after 1h and 4h of exposure to BPC1.2. In addition, both BPCs produced an increase in intracellular Ca2+ levels – BPC1.2 induced Ca2+ efflux from lysosomes, mitochondria and the ER; BPC1.1 caused efflux of mitochondrial Ca2+. Intracellular levels of caspase-8, caspase-3, cytochrome c, cathepsin L, bax and bid were also shown to be altered. Conclusions: The comparative study of the effects of the BPCs upon metastatic melanoma cells allowed us to observe that, despite both complexes being equally cytotoxic against the assayed cell lines, they differ substantially in their main mechanisms of action, especially in relation to the involvement of the mitochondria-lysosome axis. BPC1.1 primarily targets mitochondria, and lysosomal effects are observed later. On the other hand, BPC1.2 induces Ca2+ mobilization from several different intracellular compartments, and this event results in an intense disruption of mitochondrial membrane potential, as well as alteration of lysosomal pH. This data allows us to suggest that the molecular mechanisms of cell death brought about by the BPC complexes are a consequence of the early, as well as sustained, mobilization of intracellular calcium.

Objetivo: Analisar comparativamente os mecanismos moleculares envolvidos na atividade citotóxica dos complexos BPC1.1 e BPC1.2 em linhagens de melanoma metastático humano e murino apresentando ou não mutações no gene correspondente a isoforma B da proteína RAF. Métodos: As linhagens de melanoma murino B16F10-Nex2 e melanoma humano CHL-1, A375, Skmel-110, Skmel-05 e A2058 foram selecionadas como modelos de estudo nos ensaios de redução de MTT. Nas linhagens A2058 e Skmel-110 foram realizados os ensaios de morte celular por meio de marcação com iodeto de propídeo. Para a linhagem A2058 foram realizados os ensaios para análise de formação de espécies reativas de oxigênio, alterações no potencial de membrana mitocondrial, quantificação de organelas vesiculares ácidas e análise da alteração do pH lisossomal, alterações nos níveis intracelulares de Ca2+ e das proteínas caspase-8, caspase-3, citocromo c, catepsinas B e L, bax e bid. Resultados: Os dois complexos apresentaram atividade citotóxica sobre as seis linhagens avaliadas, (IC50 entre 3,5 a 20 μM) após 24h de tratamento. As linhagens de melanoma humano A2058 e Skmel-110 foram selecionadas e por meio de marcação com iodeto de propídeo verificamos que os BPCs foram capazes de aumentar significativamente o número de eventos na fração sub-G1 em ambas as linhagens após 24h de tratamento e, após 6h, somente o complexo BPC1.2 foi efetivo, sendo a linhagem A2058 mais sensível ao tratamento com os BCPs e, portanto, selecionada para os ensaios de marcação com Anexina V-FITC/PI, onde verificamos que os complexos foram capazes de induzir morte celular por diferentes vias, que envolvem aumento de ROS induzido de forma tempo-dependente (intensificado após 4h de tratamento); perda do potencial de membrana mitocondrial (após 1h de incubação, intensificada após 6h de tratamento); aumento significativo na quantidade de compartimentos ácidos após 6h de tratamento (para o BPC1.1) em marcação com laranja de acridina. Em marcação com LysoSensor Green DND-189 observamos para o BPC1.2, que após 1 e 4h de tratamento houve alteração de pH lisossomal. Os BPCs induziram aumento nos níveis de Ca2+ intracelular. BPC1.2 induziu o efluxo de Ca2+ de compartimentos lisossomais, mitocondriais e do retículo. Para o BPC1.1 observamos efluxo de Ca2+ de compartimentos mitocondriais. Foram verificadas alterações nos níveis intracelulares de caspase-8, caspase-3 e citocromo c, catepsina L, bax e bid. Conclusões: O estudo comparativo da ação dos BPCs em células de melanoma metastático demonstrou que ambos os complexos são igualmente citotóxicos para as linhagens avaliadas, porém diferem em seus mecanismos de ação. Alguns aspectos temporais foram distintos quanto ao envolvimento do eixo mitocôndria-lisossomos, demonstrando que o complexo BPC1.1 tem primariamente como alvo a mitocôndria, desencadeando posteriormente alterações lisossomais, ao contrário do complexo BPC1.2, que é capaz de induzir a mobilização de cálcio em diferentes compartimentos intracelulares resultando em alteração no potencial de membrana mitocondrial mais intensa e alteração no pH intralisossomal, em comparação ao BPC1.1, o que nos permite sugerir que as alterações celulares desencadeadas pelos complexos que resultam na indução da morte celular são consequência da mobilização inicial e sustentada de cálcio intracelular.
Keywords Calcium
Cancer
Melanoma
Cancer
Calcio
Language Portuguese
Date 2017-08-31
Research area Produtos Naturais, Desenvolvimento De Fármacos E Biomarcadores
Knowledge area Fisiologia E Farmacologia
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 0p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=5712768
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50070

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