Descoberta de compostos com amplo espectro contra Trypanosoma cruzi por meio de triagem de alto conteúdo

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dc.contributor.advisor Moraes, Carolina Borsoi [UNIFESP]
dc.contributor.author Franco, Caio Haddad [UNIFESP]
dc.coverage.spatial São Paulo, Escola Paulista de Medicina (EPM) pt_BR
dc.date.accessioned 2019-03-20T10:19:24Z
dc.date.available 2019-03-20T10:19:24Z
dc.date.issued 2018
dc.identifier.citation FRANCO, Caio Haddad. Descoberta de compostos com amplo espectro contra Trypanosoma cruzi por meio de triagem de alto conteúdo. 221 f. Tese (Doutorado em Ciências) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2018. pt_BR
dc.identifier.uri http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/49804
dc.description.abstract A tecnologia de high content screening (HCS) permite a triagem de uma grande quantidade de moléculas dentro de um período relativamente curto de forma eficiente e robusta. Sabendo que o Trypanosoma cruzi é promíscuo em relação a infecção de células hospedeiras de mamíferos para ensaios in vitro, praticamente qualquer célula nucleada pode ser usada para triagem fenotípica. No entanto, a dinâmica celular e as interações parasito-hospedeiro podem desempenhar um papel importante nos resultados de triagem e seleção de compostos. Além disso, T. cruzi é uma espécie heterogênea subdividida em seis grupos filogenéticos distintos que também podem apresentar variabilidade na susceptibilidade aos diferentes compostos testados in vitro e in vivo. Um ensaio de HCS para a forma intracelular de diferentes cepas de T. cruzi e em tipos de células hospedeiras distintas foi desenvolvido e validado. Em seguida uma biblioteca contendo compostos foi submetida ao processo de triagem no qual foi identificado e confirmado um composto análogo a auraquina D, com atividade inédita anti-T. cruzi. Em relação ao ensaio com diferentes cepas, a biblioteca Pathogen Box foi triada contra as cepas de T cruzi Sylvio X10/1, Y clH10 e CL Brener, apresentando um perfil distinto de atividade para cada uma. Das 400 amostras testadas, os compostos MMV689028, MMV689029 MMV688958 e MMV688795 foram os únicos selecionados contra as três cepas. Apesar de conhecidas como agentes anti-kineoplastídeos, o amplo espectro de ação dessas moléculas contra as cepas de T. cruzi nunca havia sido explorado. A fim de verificar o efeito da célula hospedeira utilizada no ensaio de alto conteúdo, e sua consequência na seleção de hits, 1.280 compostos foram testados contra amastigotas infectando células das linhagens U2OS, THP-1, VERO e L6. Observamos que existe uma sobreposição muito baixa de compostos selecionados quando células hospedeiras distintas são utilizadas em screening de compostos contra T. cruzi. Os ensaios confirmatórios destacaram os compostos CB1954, FPL64176, AEG3482 e entecavir pela potência e seletividade satisfatórias. Uma outra abordagem na qual empregamos a técnica de high content screening foi o estudo de resistência de T. cruzi aos compostos azólicos e inibidores de CYP51, proposto por muitos como um alvo validado para a quimioterapia de doença de Chagas. Um clone da cepa Y foi cultivado sob concentrações crescentes de ravuconazol, até atingir estabilidade in vitro sob 500 nM. O clone resistente exibiu uma taxa de infecção reduzida e um baixo número de amastigotas intracelulares, quando comparado ao clone parental, in vitro. O clone resistente também apresentou um processo de epimastigogênese lento e diminuiu o tempo de duplicação de população de epimastigota. Nos ensaios de atividade de fármacos, o ravuconazol foi pelo menos 1.000 vezes menos potente no clone resistente e o fenótipo foi mantido mesmo após várias semanas sem a pressão do composto e também após submeter o parasita a um ciclo de vida completo in vitro. O clone resistente ao ravuconazol também mostrou resistência cruzada a outros inibidores azólicos e não azólicos da CYP51, mas não aos nitroheterocíclicos benznidazol e nifurtimox, que agem sob outro mecanismo de ação. Uma nova mutação na TcCYP51 foi identificada no clone resistente. Espera-se que estes resultados auxiliem no entendimento da resistência natural de algumas cepas de T. cruzi aos inibidores de CYP51 e permita um maior entendimento do papel das isoformas de CYP51 na biologia do parasita. Os resultados obtidos nesse estudo apontam para novas perspectivas na descoberta e desenvolvimento de fármacos para doença de Chagas. pt_BR
dc.description.abstract The high content screening (HCS) technology allows the evaluation of a large number of molecules within a relatively short period of time in an efficient and robust manner. It is well known that Trypanosoma cruzi is promiscuous in terms of mammalian cells infection for in vitro assays, therefore, basically any nucleated cell can be used for phenotypic screening against this parasite. However, cellular dynamics and the specific host-parasite interactions may play important role in the screening results and in hit compound selection. Besides, T. cruzi is a heterogeneous species subdivided into six distinct ephylogenetic groups which may present variable susceptibility to different compounds tested both in vitro and in vivo. A HCS assay was developed and validated using the intracellular stage of different T. cruzi strains and several host cell types. Next, a 1,604-sample library was screened and an aurachin D analogue compound was identified and confirmed with a previously undescribed anti-T. cruzi activity. Regarding the different strains assay, the Pathogen Box library was screened against T. cruzi strains Sylvio X10/1, Y clH10 e CL Brener, presenting a distinct activity profile for each infected cell lineage. From the 400 samples tested, compounds MMV689028, MMV689029 MMV688958 e MMV688795 were the only hits selected against all three strains. Although these molecules are known anti-kinetoplastid agents, the broad-spectrum profile against different T. cruzi strains had not been explored yet. In order to evaluate the host cell type in T. cruzi high content assays, and the implications with compound selection, 1,280 compounds were tested against T. cruzi amastigotes infecting four host cell lineages: U2OS, THP-1, VERO e L6. We observed a low overlap of selected compounds within distinct host cells used in anti-T. cruzi compound screening. After confirmatory assays, compounds CB1954, FPL64176, AEG3482 and entecavir stood out in terms of potency, efficacy and selectivity. Another study in which we applied the high content assay methodology was on T. cruzi drug-induced resistance against azoles and other CYP51 inhibitors, considered by many as a well-validated antichagasic chemotherapeutical target. A Y strain clone was cultivated under increasing ravuconazole concentrations until reaching in vitro stability at 500 nM. The resistant clone exhibited a reduced infection ratio profile and low number of intracellular amastigotes, when compared to susceptible parental clone, in vitro. The resistant parasites also presented a slower epimastigogenesis process and decreased the epimastigote doubling time. In drug activity assays, ravuconazole was at least 1,000 times less potent against the resistant clone and this phenotype was maintained after several weeks, even without drug pressure and also after submitting the parasite into a complete in vitro life cycle. Ravuconazole resistant clones also presented cross-resistance to other azole and non-azoles CYP51 inhibitors, but not to nitroheterocyclic compounds benznidazole and nifurtimox, which act via different mechanism of action. A novel TcCYP51 mutation was identified in the resistant parasites. We hope these results will aid the understanding of natural-resistance occurrence in some T. cruzi strains to CYP51 inhibitors, allowing also a better elucidation of the role of TcCYP51 different isoforms in the parasite biology. The results obtained from this study point towards new perspectives in Chagas disease drug discovery en
dc.description.sponsorship Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pt_BR
dc.format.extent 221 f. pt_BR
dc.language por pt_BR
dc.publisher Universidade Federal de São Paulo pt_BR
dc.rights Acesso aberto pt_BR
dc.subject Trypanosoma cruzi pt_BR
dc.subject Triagem de alto conteúdo
dc.subject Descoberta de fármacos pt
dc.subject Fármacos de amplo espectro pt
dc.subject Esterol 14alfa-desmetilase (TcCYP51) pt
dc.subject Microscopia automatizada pt
dc.title Descoberta de compostos com amplo espectro contra Trypanosoma cruzi por meio de triagem de alto conteúdo pt_BR
dc.title.alternative Discovery of broad spectrum compounds against Trypanosoma cruzi throughout high content screening pt_BR
dc.type Tese de doutorado pt_BR
unifesp.campus Escola Paulista de Medicina (EPM) pt_BR
unifesp.graduateProgram Microbiologia e Imunologia pt_BR
dc.contributor.authorLattes http://lattes.cnpq.br/1083314820023553 pt_BR
dc.contributor.advisorLattes http://lattes.cnpq.br/2856012942943418 pt_BR
unifesp.departamento Microbiologia, Imunologia e Parasitologia pt_BR



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Name: Tese-16725.pdf
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Format: PDF
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