Avaliação da interação entre o papilomavírus bovino e a célula hospedeira

Avaliação da interação entre o papilomavírus bovino e a célula hospedeira

Author Melo, Thatiana Correa de Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Kerkis, Irina Kerkis Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Biologia Estrutural e Funcional
Abstract Bovine papillomaviruses (BPVs) are oncogenic virus, with epithelium and mucous tropism, associated to benign lesions which can progress to malignancy, principally in presence of the environmental co-factors. Currently, there are 13 types of BPV described, classified in three genres: Delta, Epsilon and Xipapillomavirus. Objectives: This study aimed to identify the interaction between the BPV with primary cell cultures, as well as the virus with peripheral blood cells from bovines infected by BPV with different clinical characteristics of bovine papillomatosis. The viral activity was evaluated through the BPV proteins expression, morphological alterations and levels of clastogenicity. Methods: Samples of peripheral blood and tissue were collected from bovines uninfected by BPV, as well as, animals with cutaneous papillomas, esophagus and urinary bladder papillomas. The tissue samples were submitted to histopathological analysis and BPV detection. Primary cell cultures of each tissue sample were stablished and submitted to the investigation for lineage characterization by morphology, cytoskeletal (vimentin, cytokeratin, E-cadherin, ?-cathenin and actin), focal adhesion (vinculin), expression of E7 oncoprotein, replication (E2 e E1^E4) and capsid protein (L1) of BPV. Cell circle alterations, the levels of clastogenicity and the virus particle presence were analyzed in these systems. Results and Discussion: the presence of viral DNA, in episomal state, was detected in the passages of cell culture (P1-P6). Furthermore, the viral proteins expression was detected by RT-PCR, immunofluorescence and flow cytometry. Oncoprotein E7 was identified in cytoplasmatic region, the E2 and E1^E4 proteins were identified in the nucleus and cytoplasm and the L1 protein was present in nuclear and perinuclear region of culture cell and peripheral mononuclear cells (PBMCs). These same proteins were detected in paraffined tissue, being observed in epithelium and dermis. High levels of clastogenicity were identified both in cell culture and PBMCs in all groups of animals with papillomas, but not detected on uninfected bovines. Electron microscopy analysis showed the presence of structures very similar to virus particles. Culture cells from animals infected by BPV showed double labeling of vimentin/cytokeratin and alteration in the labeling standard of E-cadherin and ?-cathenin. Specifically, ?-cathenin was expressed in the cytoplasm and nucleus. These data suggest that these cells could be suffering an epithelial-mesenchymal transition (EMT). The EMT is responsible for the invasion/migration of cells with transformed phenotype, contributing to the metastasis genesis. Furthermore, the culture cells infected by BPV showed nuclear and depolarized F-actin. The protein was retracted in the cellular matrix. The presence of lamelipoids was detected. Probably, these alterations are result of viral protein activity. Conclusion: DNA virus presence in the passages, morphologic alterations and clastogenicity, as well as, the presence of BPV particles and protein expression represent strong evidences that the virus is active, occurring virus assembling in vitro. Alterations in cytoskeleton proteins and co-expression of proteins of epithelial and mesenchymal origin point out that the culture cells are suffering neoplastic modifications, characterized by EMT.

Os papilomavírus bovino (BPV) são vírus oncogênicos, com tropismo para o epitélio e mucosa, associados a lesões benignas que podem progredir à malignidade, principalmente quando na presença de co-fatores ambientais. Atualmente existem 13 tipos de BPVs descritos, classificados em três gêneros: Delta, Epsilon e Xipapillomavirus. Objetivo: Identificar a interação do BPV com células obtidas de culturas primárias e sangue periférico, provenientes de bovinos infectados, apresentando diferentes características clínicas da papilomatose. Métodos: A atividade viral foi avaliada através da análise de expressão de proteínas do BPV por RT- PCR, imunofluorescência, citometria de fluxo, alterações morfológicas e clastogênicas. Foram coletadas amostras de sangue e biópsias de animais não infectados pelo BPV e de animais infectados com o vírus, com papilomatose cutânea, papilomas de esôfago e papilomas de bexiga. Os fragmentos de tecido foram analisados histopatologicamente e, submetidos à detecção de DNA viral. Foram estabelecidos cultivos primários de cada grupo. Cada linhagem foi caracterizada de acordo com a morfologia, marcação de proteínas do citoesqueleto (vimentinas, citoqueratina, E- caderina, ?-catenia e actina) e adesão focal (vinculina), expressão da oncoproteína E7, proteínas de replicação (E2 e E1^E4) e do capsídeo (L1) do BPV, alterações clastogênicas, ciclo celular e investigação da presença de partículas virais nestes sistemas. Resultados e Discussão: Detectou-se a presença do DNA viral por PCR, sendo identificada por hibridização in situ a presença do genoma viral no estado epissomal em passagens celulares (P1-P6) dos cultivos estabelecidos. Além disso, a expressão da proteína E7 (região citoplasmática), das proteínas E2 e E1^E4 (núcleo e citoplasma) e da proteína L1 (região nuclear e perinuclear) foi observada nas células de cultivo primário e em células mononucleadas de sangue periférico (PBMCs). Estas mesmas proteínas foram detectadas por imunoistoquímica em tecido parafinado, sendo observada a expressão na região do epitélio e da derme. Níveis elevados de clastogenicidade foram identificados, tanto no cultivo quanto nos PBMCs, nos grupos de animais clinicamente afetados (papiloma cutâneo e papiloma interno). Análises de microscopia eletrônica evidenciaram a presença de estruturas similares a partículas virais. As células de cultivo dos grupos clinicamente afetados por BPV apresentaram dupla marcação de vimentina/citoqueratina e padrão de marcação alterado de E-caderina e ?- catenina. A ??catenina se mostrou expressa no citoplasma e no núcleo. Estes dados sugerem que essas células se encontram em transição epitélio-mesênquima (TEM). A TEM é responsável pela invasão/migração de células com fenótipo cancerígeno, contribuindo na gênese de metástases. As células cultivadas com BPV possuíam: F-actina nuclear e F- actina despolimerizadas e retraídas na matriz celular. Além disso, foi observada a formação de lamelipóidios. Provavelmente estas alterações são decorrentes da atividade de proteínas virais. Conclusões: A presença de DNA do vírus nas passagens, alterações morfológicas e clastogênicas, bem como a presença de supostas partículas do BPV e expressão de proteínas representam evidências de que o vírus pode estar se montando e mantendo atividade in vitro. Alterações tanto das proteínas do citoesqueleto, quanto a co-expressão de proteínas de origem epitelial e mesenquimal apontam para as primeiras modificações celulares de um processo de desenvolvimento neoplásico.
Keywords papilomavírus bovino
primary culture
protein expression bpv
oncogenic virus
clastogenicity
bovino
papilomavírus bovino
cultura primária
expressão de proteínas do bpv
vírus oncogênico
clastogênese
bovino
Language Portuguese
Date 2015-02-27
Published in MELO, Thatiana Correa de. Avaliação da interação entre o papilomavírus bovino e a célula hospedeira. 2015. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.
Research area Biologia geral
Knowledge area Ciências biológicas
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=3109553
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/47510

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