Supressor tumoral abi3 (abi family member 3): desvendando os mecanismos moleculares nos tumores da tiroide humana

Supressor tumoral abi3 (abi family member 3): desvendando os mecanismos moleculares nos tumores da tiroide humana

Author Moraes, Lais de Sousa Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Cerutti, Janete Maria Cerutti Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Biologia Estrutural e Funcional
Abstract We identified the loss of ABI3 gene expression in thyroid carcinomas. Functional analysis demonstrated that ectopic expression of ABI3 inhibits cell growth, invasion, migration and tumor growth in vivo associated with an increased in cellular senescence, suggesting ABI3 as a potential tumor suppressor. Nevertheless, there is no genetic/ epigenetic mechanisms described as associated with its loss of expression, and it is still unknown the signaling pathway by which ABI3 exerts its function. Based on these data about ABI3, our first objective was to investigate if DNA methylation could be the mechanism responsible for the loss of ABI3 expression in follicular thyroid carcinoma (FTC). The cell lines derived from follicular thyroid carcinoma (WRO, FTC 238, and FTC236 FTC133) and melanoma (NPA) were treated with demethylating agent (5-Aza) and the level of ABI3 expression was assessed. We observed the restoration of ABI3 expression in follicular carcinoma cell lines treated with 5-Aza (P<0.01). Thus, we correlated the level of ABI3 expression with degree of methylation of its promoter. Although the in silico analysis showed that ABI3 has no CpG islands, we identify the occurrence of multiple adjacent CpG sites in its promoter. These regions called R1, R2 and R3 were evaluated. The degree of methylation of R1 region was inversely correlated with ABI3 expression in these cells (P<0.05). These data were validated on FTC (n=17) and follicular thyroid adenomas (FTA) (n=11) samples. We observed a hypermethylation of R1 in CFT when compared to the AFT (P<0.001), which correlated with the expression of ABI3 (P=0.0002). Interestingly, we identified in R1 a canonical site for the thyroid transcription factor NKX2-1, flanked by the CpG sites. The analysis revealed that ABI3 was expressed in the presence of NKX2-1 and when R1 region is hipomethylated. Luciferase assays suggested that R1 might be a potential enhancer. Our data suggest that ABI3 expression in thyroid tumors appears to be regulated by R1 methylation degree in ABI3 promoter associated with expression of NKX2-1. Yet, to better understand the molecular mechanisms involved in the role of ABI3 in thyroid cancer, our second objective was to investigate the signaling pathways by which ABI3 acts exercising their suppressive effect in thyroid carcinomas. To this end, the follicular thyroid carcinoma cell lines, WRO and FTC133 were transfected with the expression vector containing the wild type cDNA of ABI3 and negative control, the empty vector. Initially, we used the Proteome Profiler Array to identify the signaling pathways, and some pathways described as having been a role in several types of cancer were identified as modulated by ABI3, particularly AKT pathway was enriched in our analysis. To better determine the location of the ABI3 in the signaling pathway, we performed immunoprecipitation assays (IP) and mass spectrometry analysis that showed ABI3 as a part of the WAVE regulatory complex (WRC) with WAVE2 and CYFIP1 proteins. To validate these data, the cells lines were treated with AKT inhibitor (LY294002). In addition, the ABI3 S342A mutant was generated by site-directed mutagenesis. The determination of S342 site was performed by in silico analysis with MotifScan. For the first time, our studies with AKT inhibitor and S342A mimetic mutant of non-phosphorylated form of ABI3 demonstrated that ABI3 is a phosphoprotein, directly phosphorylated by AKT in S432. And this phosphorylation probably interferes with the formation of the WRC complex. The results were observed in both cell lines and the correlation between ABI3, WAVE2 and CYFIP1 was validated in samples of patients (n=23) that expressed ABI3, FTA and normal thyroid tissue (P<0.05). These data are new in the literature and suggests a relationship between the ABI3 phosphorylation, AKT and the formation of WRC complex. Furthermore, these data suggest a possible pathway by which ABI3 acts exerting its suppressive effects, particularly their effects on cell growth and migration.

Nosso grupo identificou a perda de expressão do gene ABI3 nos carcinomas da tiroide. A análise funcional demonstrou que o reestabelecimento da expressão de ABI3 resulta na inibição das taxas de proliferação celular, invasão, migração e crescimento tumoral in vivo, associado ao aumento das taxas de senescência celular, sugerindo que ABI3 atue como um gene supressor de tumor. Porém ainda não há mecanismos genéticos/epigenéticos descritos que expliquem a mudança do perfil de expressão, assim como, ainda é pouco conhecida a via de sinalização pela qual ABI3 exerce sua função. Com base nos dados acerca da expressão de ABI3 nos tumores da tiroide, nosso primeiro objetivo foi investigar se a metilação no DNA poderia ser o mecanismo responsável pela perda de expressão de ABI3 nos carcinomas foliculares da tiroide (CFT). As linhagens celulares derivadas de carcinoma folicular da tiroide (WRO, FTC 238, FTC236 e FTC133) e de melanoma (NPA) foram tratadas com agente desmetilante (5-Aza) e o nível de expressão de ABI3 avaliado. Observamos a reexpressão de ABI3 nas linhagens de carcinoma folicular tratadas com 5-Aza (P<0,01). Desta forma, correlacionamos o nível de expressão de ABI3, com grau de metilação de seu promotor. Embora a análise in silico demonstrou que ABI3 não apresenta ilhas CpGs, identificamos a ocorrência de múltiplos sítios CpGs, adjacentes em seu promotor. Estas regiões, denominas regiões R1, R2 e R3, foram avaliadas. O grau de metilação da região R1 apresentou correlação inversa com a expressão de ABI3 nas células de CFT (P<0,05). Estes dados foram validados em amostras de CFT (n=17) e adenomas foliculares da tiroide (AFT) (n=11). Observamos uma hipermetilação de R1 nos CFT quando comparados aos AFT (P<0,001), o qual correlacionou com a expressão de ABI3 (P= 0,0002). Interessante, identificamos a presença de um sítio canônico para o fator 14 de transcrição tiroidiano NKX2-1 na R1, que flanqueia sítios CpGs. A análise da expressão de NKX2-1 revelou que ABI3 é expresso na presença de NKX2-1 e quando a região R1 encontra-se hipometilada. Os ensaios de Luciferase sugeriram que R1 pode ser um potencial enhancer. Nossos dados sugerem que a expressão de ABI3 nos tumores da tiroide parece ser regulada pelo grau de metilação de R1 no promotor de ABI3 associada a expressão de NKX2-1. Ainda, para melhor compreender os mecanismos moleculares envolvidos no papel de ABI3 no câncer de tiroide, nosso segundo objetivo foi investigar as vias de sinalização pelas quais ABI3 atua exercendo seu efeito supressor nos carcinomas da tiroide. Para isso, as linhagens celulares de carcinoma folicular da tiroide, WRO e FTC133, foram transfectadas com vetor de expressão contendo o cDNA Wild type de ABI3 e, controle negativo, o vetor vazio. Iniciamos pela identificação das vias de sinalização por Proteome Profiler Array, em que identificamos diversas vias já descritas como tendo papel em diversos tipos de câncer moduladas por ABI3, em especial, a via de AKT se mostrou enriquecida em nossas análises. Para melhor determinar a localização de ABI3 na via de sinalização, realizamos os ensaios de imunoprecipitação (IP) e espectrometria de massas que demonstraram que ABI3 faz parte do complexo regulatório WAVE (WRC) com as proteínas WAVE2 e CYFIP1. Para validação desses resultados as células foram tratadas com inibidor da via de AKT (LY294002). Além disso, foi gerado o mutante S342A de ABI3 por mutação sitio-dirigida e as vias reavaliadas por Western-Blot e IP. A determinação do sítio S342 foi realizada por análises in sílico com a ferramenta MotifScan. Pela primeira vez, nossos estudos com o inibidor de AKT e o mutante S342A mimético da forma não-fosforilada de ABI3, demonstraram que ABI3 é uma fosfoproteína, sendo diretamente fosforilada por AKT na S432 e que essa fosforilação provavelmente interfere na formação do complexo WRC. Os resultados foram observados em ambas as linhagens celulares. E a correlação entre ABI3 e as proteínas WAVE2 e CYFIP1 do complexo foi validada em amostras de pacientes (n=23) 15 com expressão de ABI3, AFT e tecido tiroidiano normal (P<0,05). Esses dados são inéditos na literatura, sugerindo uma relação entre a fosforilação de ABI3, AKT e a formação do complexo WRC. Ainda, esses dados sugerem uma possível via pela qual ABI3 atua exercendo seu efeito supressor, em especial, seus efeitos no crescimento e migração celular.
Keywords neoplasms of the thyroid gland
abi genes
methylation of dna
proteomics
protein family of wiskott-aldrich syndrome
oncogenic protein akt
neoplasias da glândula tireoide
genes abi
metilação de dna
proteômica
família de proteínas da síndrome de wiskott-aldrich
proteína oncogênica akt
Language Portuguese
Date 2016-08-24
Published in MORAES, Lais de Sousa. Supressor tumoral abi3 (abi family member 3): desvendando os mecanismos moleculares nos tumores da tiroide humana. 2016. 145 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.
Research area Biologia geral
Knowledge area Ciências biológicas
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 145 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=4017158
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/47364

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