Investigação da expressão dos marcadores de células tronco em linhagem celular de melanoma murino e sua reprogramação em células pluripotentes induzidas

Investigação da expressão dos marcadores de células tronco em linhagem celular de melanoma murino e sua reprogramação em células pluripotentes induzidas

Author Camara, Diana Aparecida Dias Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Kerkis, Irina Kerkis Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Biologia Estrutural e Funcional
Abstract Malignant melanoma is a heterogeneous tumor that originates from melanocytes that have suffered genetic and epigenetic mutations. Some studies have shown reversal of the phenotype of human metastatic melanoma cells at the embryonic microenvironment via a cellular reprogramming. The use of reprogramming is a good starting point, which can significantly contribute to the understanding of the main molecular mechanism related to the pathogenesis of this aggressive tumor and develop new biological strategies based on anticancer therapies. Objective: The objectives of this paper were to study the expression of stem cell markers in a murine melanoma cell line and establish a model for studying the possible cellular mechanisms of loss of malignancy through reprogramming of tumor cells in ?normal? IPS. Materials and Methods: Seven clones were isolated using the limiting dilution assay from the cell line B16F10. These clones were characterized by flow cytometry with surface markers (CD271, CD146 and CD44, CD24) by qPCR for pluripotency markers. Cell cycle analysis was performed and some proteins were analyzed by Western blot, such as cyclin D and cyclin DNMT1. Each clone was tested for the UFC, sphere formation and tumorigenic ability in vivo. The individual sensitivity of each clone and the parent strain in the presence of antitumor drugs was evaluated in vitro. One clone was chosen and transfection was performed using circular plasmid DNA containing -2 Sox genes, Oct4, Nanog, Lin28 and GFP. Results: the clones showed different patterns of cell proliferation, expression of surface markers, tumorigenicity, metastatic capacity and drug resistance. This heterogeneous and divergent character between clones occurred spontaneously under the same culture conditions showing tumor plasticity. Clone 7, which was used for the reprogramming assays, obtained high efficiency in transfection when compared to the fibroblasts used for control, however reprogramming showed low efficiency as evidenced by the appearance of a small number of colonies morphologically similar to melanospheres. Conclusions: We conclude that heterogeneity is an intrinsic characteristic of melanomas that contributes to the wide phenotypic diversity found in these tumors. An interesting way to modulate this phenomenon is the reprogramming of these tumor cells and the verification of what it entails in terms of expression of tumor markers and also of CTT.

O melanoma maligno é um tumor heterogêneo, originado a partir de melanócitos que sofreram mutações genéticas e epigenéticas. Alguns estudos demonstraram a reversão do fenótipo de células de melanoma metastático humano pelo microambiente embrionário, através de uma reprogramação celular. O uso de reprogramação é um bom ponto de partida, o que pode contribuir significativamente para a compreensão do mecanismo molecular principal subjacente à patogênese deste tumor agressivo e desenvolver novas estratégias biológicas baseadas em terapias anticâncer. Objetivo: os objetivos deste trabalho foram o de estudar a expressão dos marcadores das células tronco em uma linhagem celular do melanoma murino e estabelecer um modelo para estudar os possíveis mecanismos celulares de perda da malignidade através de reprogramação das células tumorais em CT ?normais? pluripotentes (CPI). Materiais e Métodos: sete clones foram isolados utilizando o ensaio de diluição limitante, a partir da linhagem de células B16F10. Estes clones foram caracterizados por citometria de fluxo com marcadores de superfície (CD271, CD146 e CD44, CD24), por qPCR para marcadores de pluripotência. Foi realizada a análise do ciclo celular e algumas proteínas foram estudadas por Western Blot, tais como, ciclina D, ciclina e DNMT1. Cada clone foi testado quanto a UFC, formação de esfera e a capacidade tumorigênica in vivo. Foi avaliada a sensibilidade individual de cada clone e da linhagem parental na presença de drogas antitumorais in vitro. Um clone foi escolhido e a transfecção foi realizada utilizando DNA plasmidial circular contendo os genes Sox -2, Oct4, Nanog, Lin28 e GFP. Resultados: os quais demonstraram diferentes padrões de proliferação celular, expressão de marcadores de superfície, tumorigenicidade, capacidade metastática e resistência a drogas. Este caráter heterogêneo e divergente entre os clones ocorreu espontaneamente sob as mesmas condições de cultura evidenciando a plasticidade tumoral. O clone 7, o qual foi usado para os ensaios de reprogramação, obteve uma alta eficiência na transfecção quando comparado aos fibroblastos utilizados como controle, porém a reprogramação demonstrou baixa eficiência, evidenciada pelo surgimento de um pequeno número de colônias morfologicamente semelhantes as melanoesferas. Conclusões: Assim, concluímos que a heterogeneidade é uma característica intrínseca dos melanomas que contribui para a grande diversidade fenotípica encontrada nestes tumores. Uma forma interessante para se modular este fenômeno é a reprogramação destas células tumorais e verificação do que esta reprogramação acarreta em termos de expressão de marcadores tumorais e também de CTT.
Keywords melanoma
reprogramming
heterogeneity
cancer stem cells
melanoma
reprogramação
heterogeneidade
células tronco tumorais
Language Portuguese
Date 2015-02-26
Published in CAMARA, Diana Aparecida Dias. Investigação da expressão dos marcadores de células tronco em linhagem celular de melanoma murino e sua reprogramação em células pluripotentes induzidas. 2015. 60 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.
Research area Biologia geral
Knowledge area Ciências biológicas
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 60 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=2208371
Access rights Closed access
Type Dissertation
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/47258

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