Influência do estrógeno na regulação da autofagia e apoptose dos osteócitos no processo alveolar de ratas ovariectomizadas

Influência do estrógeno na regulação da autofagia e apoptose dos osteócitos no processo alveolar de ratas ovariectomizadas

Author Silva, Rinaldo Florencio da Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Simoes, Manuel de Jesus Simoes Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Biologia Estrutural e Funcional
Abstract Autophagy is a process that reduces cell stress and enhances cell survival. Estrogen is a hormone that inhibits bone resorption and osteocyte apoptosis, promoting bone homeostasis. However, it is not clear if estrogen interfere in the autophagy process to assure osteocyte survival. Objective: To evaluate the influence of estrogen in the incidence of autophagy and apoptosis in the osteocytes of alveolar process of ovariectomized rats. Material and methods: Sixty adult female rats were SHAM-operated (SHAM) or ovariectomized (OVX) and treated with estrogen (OVXE group) or received vehicle solution (SHAM and OVX groups) for 15, 30 and 45 days. Six SHAM and six OVX rats were euthanized before treatments and used as basal groups (SHAMBL and OVXBL). After treatments and euthanasia, the maxillae containing the first molars were processed for paraffin and Araldite embedding. HE stained sections were used for histomorphometry to obtain the interradicular bone area and the number of osteocyte and empty lacunae. Sections were also subjected to the silver impregnation method to analyze the osteocyte cytoplasmic processes, and to the TRAP method to obtain the osteoclast number. Sections were submitted to the TUNEL and immunohistochemical methods to analyze apoptosis (cleaved caspase-3, BAX, Bcl2 and HMGB1) and autophagy (beclin-1, LC3II, p62, or immunofluorescence for LC3II and p62 detection); other sections were subjected to the combined TUNEL/TRAP methods, whereas semi-thin sections were submitted to the Sudan Black method (lipid detection). Results: In comparison to the SHAMBL group, OVXBL group showed higher percentages of caspase-3, TUNEL, p62-positive osteocytes, empty lacunae and osteoclasts. On the other hand, this group showed lower percentages of beclin-1 and LC3II-positive osteocytes. The estrogen treated group for 15 days presented lower percentages of caspase-3 and TUNEL-positive osteocytes, and higher percentage of LC3II-positive osteocytes when compared to the OVX group. The group treated for 30 days showed lower number of empty lacunae and lower percentages of TUNEL and p62-positive osteocytes in comparison to the OVX group. The group treated for 45 days showed higher bone area and osteocyte number, lower percentages of caspase-3, BAX, TUNEL and p62-positive osteocytes; while higher percentages of beclin-1 and LC3II-positive osteocytes was observed when compared to OVX group. The treatment with estrogen for 15 and 30 days promoted significant reduction in osteoclast number, as compared to the OVX groups. A higher percentage of HMGB1-positive-citoplasm and a lower percentage of HMGB1-positive nuclei in osteocytes were seen in the OVX groups, when compared to the SHAM and estrogen treated groups. A high frequency of lipid droplets was observed in the osteocytes of the OVX groups. The ultraestrutural images showed large cytoplasmic regions of osteocytes occupied by lipid droplets, mainly in the OVX groups, and osteocytes with ultrastructural features of apoptosis. Conclusions: Our results indicate that estrogen deficiency reduces autophagy and increase apoptosis in osteocytes, whereas estrogen treatment maintains osteocyte viability by enhancing autophagy and inhibiting apoptosis. This inverse proportional association between autophagy and apoptosis supports the idea that estrogen may play a role in the autophagy control, reducing osteocytes apoptosis.

A autofagia é um processo que reduz o estresse celular, aumentando a sobrevivência das células. O estrógeno é um hormônio que inibe a reabsorção óssea e a apoptose de osteócitos, promovendo a homeostase óssea. Porém, ainda não está claro se o estrógeno interfere no processo de autofagia para garantir a sobrevivência dos osteócitos. Objetivos: Avaliar a influência do estrógeno na incidência de autofagia e de apoptose nos osteócitos do processo alveolar de ratas ovariectomizadas. Material e métodos: Sessenta e seis ratas adultas foram SHAM-operadas (SHAM) ou ovariectomizadas (OVX) e tratadas com estrógeno (Grupo OVXE) ou receberam solução veículo (Grupos SHAM e OVX), por 15, 30 e 45 dias. Seis ratas SHAM e seis OVX foram eutanasiadas antes dos tratamentos para obtenção dos grupos basais (SHAMBL e OVXBL). Após os tratamentos e eutanásia, as maxilas contendo o primeiro molar foram processadas para inclusão em parafina e Araldite. Cortes corados com HE foram submetidos à histomorfometria para obtenção da área óssea interradicular, número de osteócitos e de lacunas vazias; outros foram submetidos aos métodos da prata para análise dos prolongamentos dos osteócitos e do TRAP para quantificação de osteoclastos. Cortes foram submetidos ao método do TUNEL e à imuno-histoquímica para análise de apoptose (caspase-3 clivada, BAX, Bcl2 e HMGB1) e autofagia (beclina-1, LC3II, p62, ou imunofluorescência para LC3II e p62), além da análise ultraestrutural. Cortes também foram submetidos aos métodos do TUNEL/TRAP combinados e cortes semifinos foram submetidos ao método de Sudan Black para detecção de lipídeo. Resultados: O grupo OVXBL mostrou maior porcentagem de osteócitos caspase-3, TUNEL e p62-positivos, menor porcentagem de osteócitos beclina-1 e LC3II-positivos, e maior número de lacunas vazias e de osteoclastos, em comparação ao grupo SHAMBL. O grupo tratado com estrógeno por 15 dias apresentou menor porcentagem de osteócitos caspase-3 e TUNEL-positivos, e maior porcentagem de osteócitos LC3II-positivos, em comparação ao grupo OVX. O grupo tratado por 30 dias mostrou menor número de lacunas vazias e de osteócitos TUNEL e p62-positivos em comparação ao OVX. O grupo tratado por 45 dias evidenciou maior área óssea e número de osteócitos, menor porcentagem de osteócitos caspase-3, BAX, TUNEL e p62-positivos, assim como maior porcentagem de osteócitos beclina-1 e LC3II-positivos, quando comparado ao grupo OVX. O tratamento com estrógeno por 15 e 30 dias promoveu diminuição significante no número de osteoclastos, em comparação aos grupos OVX. Notou-se maior porcentagem de osteócitos com citoplasma positivo ao HMGB1 e menor porcentagem de osteócitos com núcleo HMGB1- positivo nos grupos OVX. Gotículas de lipídios foram observadas com maior frequência nos osteócitos dos grupos OVX. A análise ultraestrutural evidenciou osteócitos com gotículas lipídicas ocupando amplas regiões citoplasmáticas, principalmente nos grupos OVX, e osteócitos com características ultraestruturais de apoptose. Conclusões: Nossos resultados indicam que a deficiência estrogênica diminui a autofagia e aumenta a apoptose dos osteócitos, enquanto o tratamento com estrógeno mantém a viabilidade dos osteócitos aumentando a autofagia e inibindo a apoptose, sugerindo uma associação inversamente proporcional entre esses dois processos nessas células. Esta associação inversamente proporcional entre autofagia e apoptose reforça a ideia de que o estrógeno deve participar no processo de controle da autofagia, além de reduzir a apoptose em osteócitos.
Keywords estrogens
osteocytes
autophagy
apoptosis
ratas
estrógenos
osteócitos
autofagia
apoptose ratas
Language Portuguese
Date 2015-06-24
Published in SILVA, Rinaldo Florencio da. Influência do estrógeno na regulação da autofagia e apoptose dos osteócitos no processo alveolar de ratas ovariectomizadas. 2015. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.
Research area Biologia geral
Knowledge area Ciências biológicas
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=3139563
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/46776

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