Avaliação funcional de mutações no gene da tireoperoxidase identificadas em pacientes com hipotireoidismo congenito por disormonogênese

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dc.contributor.advisor Rubio, Ileana Gabriela Sanchez de Rubio [UNIFESP] pt
dc.contributor.author Silva, Marlon Messias da Conceicao [UNIFESP]
dc.date.accessioned 2018-07-27T15:50:24Z
dc.date.available 2018-07-27T15:50:24Z
dc.date.issued 2016-08-30
dc.identifier https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=3772465 pt
dc.identifier.citation SILVA, Marlon Messias da Conceicao. Avaliação funcional de mutações no gene da tireoperoxidase identificadas em pacientes com hipotireoidismo congenito por disormonogênese. 2016. 59 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.
dc.identifier.uri http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/46534
dc.description.abstract Congenital hypothyroidism (CH) is the most common cause of mental retardation that can be prevented with early treatment, with frequency of 1/2500 birth. CH can be caused by defects in the development of thyroid (dysgenesis) or by defects in the thyroid hormone synthesis (dyshormonogenesis). The most frequent mutations associated with the dyshormonogenesis are located in the thyroid peroxidase gene (TPO). These mutations can promote the substitution, deletion or addition of amino acids resulting in the reduction of enzymatic activity by structural changes of the protein and/or impair localization in the thyrocyte. The objective of this project was to carry out the functional study of the TPO mutations p.Gly319Glu, p. Ala909Thr; Ala911fs*49, p.Gln660Glu and p.Cys296Alafs* 21 previously identified in Brazilian patients with congenital hypothyroidism due to dyshormonogenesis with partial iodine organification defect or fetal goiter. In the functional analysis the plasmid containing the wild TPO gene was used and the mutations were introduced by site directed mutagenesis. The proteins were expressed in mammalian cells HEK 293 transiently transfected using lipofectamine and cotransfected with pmaxGFP to determine the technical efficiency. After 72 hours of transfections, it was evaluated the enzymatic activity of TPO using the Amplex Red kit (Invitrogen, Carlsbad, CA USA), the size of the expressed proteins by western blot and cellular localization by immunofluorescence microscopy, always comparing the results of the mutants TPO with the wild-type. Enzymatic analysis showed reduced extracellular activity of all mutants TPO compared to wild type (p <0.05). It was observed that mutations p.Gly319Glu, p.Gln660Glu p. Ala909Thr;Ala911fs*49, e p.Cys296Alafs*21 promoted a reduction of activity of 35,3%, 38,7%, 44,30% and 49,2% of the wild type TPO, respectively. The western blot experiments showed that the proteins p.Gly319Glu and p.Gln660Glu have similar molecular size to the wild type, 103 kDa protein, the TPO p.Ala909Thr;Ala911fs*49 approximately 108 kDa due to the incorporation of 49 amino acids and the TPO p.Cys296Alafs*21 has 35 kDa, confirming to be a truncated protein in the exon 8. The Immunofluorescence results showed that all mutated TPO were expressed in HEK293 cells however, with the exception of p.Gln660Glu, all mutated TPO showed lower membrana immunostaining as compared to the wild type. We conclude therefore that the TPO alterations caused by the studied mutations reduce the catalytic capacity of the enzyme and/or its correct localization in the plasma membrane. These data may explain the CH due to thyroid hormone synthesis defect observed in the patients with these mutations. Furthermore, the intermediate enzymatic activity of TPO and the reduce presence of mutants TPO (p.Gly319Glu and p.Gln660Glu, p.Ala909Thr;Ala911fs*49) in the plasma membrane is in agreement with the less severe HC phenotype of the patients confirmed by the partial iodine organification defect. More studies are needed to understand the presence of fetal goiter in patients with p.Cys296Alafs*21 that may be associated to a very severe defect in thyroid hormone synthesis. en
dc.description.abstract O hipotireoidismo congênito (HC) é a causa mais comum de retardo mental que pode ser evitado com tratamento precoce, com frequência de 1/2500 crianças nascidas vivas. O HC pode ter origem em falhas no desenvolvimento da tireoide (disgenesias) ou defeitos na síntese hormonal (disormonogêneses). As mutações mais frequentes associadas às disormonogêneses estão localizadas no gene da tireoperoxidase (TPO). Estas mutações podem promover a substituição, deleção ou adição de aminoácidos provocando perda de atividade por alterações estruturais da proteína e/ou de localização no tireócito. O objetivo deste projeto foi realizar o estudo funcional das mutações p.Gly319Glu,p. Ala909Thr;Ala911fs*49, p.Gln660Glu e p.Cys296Alafs*21 identificadas no gene da TPO em pacientes brasileiros com hipotireoidismo congênito por disormonogenese com defeito de incorporação parcial de iodeto ou bócio fetal. Para os estudos funcionais foi utilizado plasmídeo contendo o gene da TPO selvagem e as mutações foram introduzidas por mutagênese sítio dirigida. As proteínas foram expressas em células de mamíferos HEK293 após 72 horas da transfecção transiente, utilizando polifectaminas e cotransfectando com o plasmídeo pmaxGFP para determinar a eficiência da técnica. Foi avaliada a atividade enzimática da TPO utilizando o kit Amplex red (Invitrogen, Carlsbad, CA EUA), o tamanho das proteínas mutadas por western blot e a localização celular por imunofluorescência, sempre comparando com a expressão da proteína selvagem. A análise enzimática demonstrou menor atividade extracelular em todas as proteínas mutadas quando comparada com a da TPO selvagem (p<0,05). Observou-se que as mutações p.Gly319Glu, p.Gln660Glu p. Ala909Thr;Ala911fs*49, e p.Cys296Alafs*21 promoveram perdas de atividade de 35,3%, 38,7%, 44,30% e 49,2%, respectivamente, em relação a TPO selvagem,. No Western blot foi verificada que as proteínas com as mutações p.Gly319Glu e p.Gln660Glu possuem tamanhos molecular similares à proteína selvagem com 103 kDa, a proteína mutante p.Ala909Thr;Ala911fs*49 aproximadamente 108 kDa devido a incorporação de 49 novos aminoácidos, e na deleção p.Cys296Alafs*21 35 kDa, confirmando ser uma proteína truncada no exon 8. Por imunofluorescência foi demonstrado que todas as proteínas mutadas são expressas, no entanto, com exceção da p.Gln660Glu todas as proteínas mutadas apresentaram menor imunomarcação na membrana plasmática quando comparadas à selvagem. Concluímos, portanto, que as alterações na TPO causadas pelas mutações estudadas diminuem a capacidade catalítica da enzima e/ou a sua correta localização na membrana plasmática podendo explicar o quadro de HC por defeito de síntese hormonal observado em todos os pacientes portadores das mutações. Além disso, a atividade enzimática intermediária da TPO e a presença de TPO mutada (p.Gly319Glu e p.Gln660Glu, p.Ala909Thr;Ala911fs*49) na membrana plasmática permitem explicar o quadro de HC menos severo confirmado pelo defeito parcial de incorporação de iodeto. Mais estudos são necessários para podermos compreender a presença do bócio fetal nos pacientes portadores da p.Cys296Alafs*21, que deve estar associado a um defeito muito severo de síntese hormonal. pt
dc.format.extent 59 p.
dc.language.iso por
dc.publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
dc.rights Acesso restrito
dc.subject congenital hypothyroidism en
dc.subject mutation en
dc.subject mutagenesis en
dc.subject iodide peroxidase en
dc.subject hipotireoidismo congênito pt
dc.subject mutação pt
dc.subject mutagênese pt
dc.subject iodeto peroxidase pt
dc.title Avaliação funcional de mutações no gene da tireoperoxidase identificadas em pacientes com hipotireoidismo congenito por disormonogênese pt
dc.type Dissertação de mestrado
dc.contributor.institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) pt
dc.identifier.file 2016-0049.pdf
dc.description.source Dados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2013 a 2016)
unifesp.campus São Paulo, Escola Paulista de Medicina (EPM) pt
unifesp.graduateProgram Biologia Estrutural e Funcional pt
unifesp.knowledgeArea Ciências biológicas pt
unifesp.researchArea Biologia geral pt



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