Estudo estrutural da endonuclease cas6 atuante no sistema de defesa imunoadaptativo crispr-cas de procarion

Estudo estrutural da endonuclease cas6 atuante no sistema de defesa imunoadaptativo crispr-cas de procarion

Author Goncalves, Giulliana Augusta Rangel Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Alfonso, Martin Rodrigo Alejandro Wurtele Alfonso Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Biotecnologia
Abstract The active protein in mechanisms of post-transcriptional gene silencing have been the target of several studies due to its promising applications in the field of biological sciences by specifically recognizing oligonucleotide sequences target and mediate their cleavage or repression. The Cas6 protein endonuclease belonging to the CRISPR system (regularly interspaced short clustered palindromic repeats) has recently been described in some works by recognizing a specific sequence highly conserved in prokaryotes, first mediating its cleavage and then participating in formation of a complex with other Cas proteins, culminating in the degradation of genetic material attacker by a RNA interference mechanism, conferring immunity through this system archeas and bacteria. Thus, the purpose of this work was the structural study of the Cas6 protein of T.marítima obtained by recombinant DNA technology in E. coli Rosetta (DE3) and cloned, expressed, purified and crystallized. The native and derivative crystals were subjected to tests of diffraction X-rays with resolutions up to 2.2Å being collected various data sets, where they were processed generating statistical data. Based on this data, different methods have been used to solve the protein structure: the method of molecular replacement, isomorphous replacement and anomalous dispersion. In the latter, the incorporation of a heavy metal to the protein during the step of expression was necessary. Despite the adoption of numerous attempts and different strategies, it could not resolve the structure of the endonuclease. However, it was obtained in high concentrations, and is available for future individual tests or in complex with other Cas proteins have been purified by laboratory. The structural knowledge of this protein may contribute substantially to the establishment of inhibitors scan trials and ultimately promote the development of treatmentsfor diseases caused by these organisms.

As proteínas atuantes em mecanismos de silenciamento gênico pós-transcricional têm sido alvo de diversos estudos devido a sua promissora aplicabilidade no campo das ciências biológicas por reconhecerem especificamente sequências de oligonucleotídeos alvo e mediarem sua clivagem ou repressão. A proteína Cas 6, endonuclease pertencente ao sistema CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) foi descrita recentemente em alguns trabalhos por reconhecer uma sequência de RNA específica altamente conservada em procariontes, mediando primeiramente sua clivagem e depois participando na formação de um complexo com outras proteínas Cas (CRISPR associated), culminando na degradação do material genético invasor por um mecanismo de RNA de interferência, conferindo imunidade através deste sistema em archeas e bactérias. Assim, o propósito deste trabalho foi o estudo estrutural da proteína Cas6 de T.marítima obtida através da tecnologia do DNA recombinante em E.coli Rosetta (DE3), sendo clonada, expressa, purificada e cristalizada. Os cristais nativos e derivados foram submetidos a ensaios de difrações de raios-X com resoluções de até 2.2Å sendo coletados vários conjuntos de dados, os quais foram processados gerando dados estatísticos. Com base nestes dados, diferentes métodos foram utilizados para resolver a estrutura da proteína: o método de substituição molecular, substituição isomorfa e dispersão anômala. Neste último, foi necessária a incorporação de um metal pesado à proteína durante a etapa de expressão em cultivo. Apesar da adoção das várias tentativas e das diferentes estratégias supracitadas, não foi possível resolver a estrutura da endonuclease. No entanto, a mesma foi clonada, expressa, purificada, cristalizada, submetida a ensaios de difração de raios-X, derivatizada com sais de átomos pesados e processada em diferentes softwares de solução estrutural. Obtida em altas concentrações, a proteína encontra-se disponível para ensaios individuais, complexos e ensaios de varredura de inibidores.
Keywords cas6
crispr
crispr/cas
cr-rna biogenesis
cas
crispr
crispr/cas
biogênese cr-rna
Language Portuguese
Date 2016-09-06
Published in GONCALVES, Giulliana Augusta Rangel. Estudo estrutural da endonuclease cas6 atuante no sistema de defesa imunoadaptativo crispr-cas de procarion. 2016. 63 f. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Ciência e Tecnologia, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São José dos Campos, 2016.
Research area Biotecnologia
Knowledge area Multidisciplinar
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 63 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=3686161
Access rights Closed access
Type Dissertation
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/46415

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