Efeitos do anfenaco e de sua combinação com bevacizumabe sobre a secreção de citocinas pró-angiogênicas e inflamatórias pelas células do epitélio pigmentado retiniano

Efeitos do anfenaco e de sua combinação com bevacizumabe sobre a secreção de citocinas pró-angiogênicas e inflamatórias pelas células do epitélio pigmentado retiniano

Author Miyamoto, Cristina Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Burnier Junior, Miguel Noel Nascentes Burnier Junior Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Oftalmologia e Ciências Visuais
Abstract OBJECTIVE: To evaluate the effects of amfenac (the active component of nepafenac) and its combination with bevacizumab on the secretion of pro-angiogenic and inflammatory cytokines by human retinal pigment epithelial cells. Additionally, to evaluate if chemical hypoxia with cobalt chloride, a hypoxia-mimicking agent, produces the same effect of the real hypoxia (hypoxia chamber) on the secretion of these cytokines by human retinal epithelial cells. METHODS: ARPE-19 cells were incubated under normoxia, chemical hypoxia, and real hypoxia. The cells were treated as follows: control, bevacizumab (0,25 mg/mL), amfenac (2 ng/mL), and the combination of bevacizumab (0,25 mg/mL) and amfenac (2,0 ng/mL). Media was harvested after 24h for sandwich ELISA-based angiogenesis and inflammation assays. The secretion of 10 pro-angiogenic cytokines: angiogenin, ANG-2, EGF, bFGF, HB-EGF, PDGF-BB, leptin, PIGF, HGF e VEGF; as well as of 10 inflammatory cytokines: IL-1?, IL-1?, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IFN-?, TNF-?, MCP-1, were measured. The viability/cytotoxicity was also assessed. RESUTS: Under normoxia, amfenac increased the secretion of ANG-2, HB-EGF, leptin, PDGF-BB, and PIGF, almost did not changed the secretion of EGF, and reduced the secretion of angiogenin, bFGF, HGF, and VEGF by ARPE-19 cells; the combination of the drugs elevated the secretion of all pro-angiogenic cytokines, except angiogenin, bFGF, and VEGF, whose secretion was diminished. Under chemical hypoxia, amfenac decreased the secretion of all pro-angiogenic cytokines, except ANG-2, whose secretion was increased, EGF whose secrection was practically unchanged and PIGF whose secretion was not detected by the method after the three treatments; the combination of the drugs reduced the secrection of all pro-angiogenic cytokines, except ANG-2 and HGF whose secretion were raised, and PIGF whose secretion was virtually the same. Under real hypoxia, amfenac increased the secretion of all pro-angiogenic cytokines, except angiogenin, bFGF and VEGF, whose secretion was decreased; the combination of the drugs increased the secretion of all pro-angiogenic cytokines, except VEGF. Under normoxia, amfenac practically did not altered the secretion of IL-1? and IL-13, reduced the secretion of IL-1?, IL-4, IL-8, and IL-10, and increased the secretion of IL-6, MCP-1, and TNF-?; the combination of the drugs virtually did not modified the secretion of IL-1?, IL-8, and IL-10, diminished the secretion of IL-1?, and increased the secretion of the remaining inflammatory cytokines. Under chemical hypoxia, amfenac practically did not changed the secretion of IL-1?, IL-1?, and IFN-?, reduced the secretion of IL-10, IL-13, and TNF-?, and elevated the secretion of all other inflammatory cytokines; the combination of the drugs virtually did not modified the secretion of IL-1?, decreased the secretion of IL-10, IL-13, and TNF-?, and increased the secretion of the remaining inflammatory cytokines. Under real hypoxia, amfenac reduced the secretion of all inflammatory cytokines; the combination of the drugs also decreased the secretion of the inflammatory cytokines apart from IFN-?, whose secretion increased; the combination of the drugs caused a more pronounced reduction in the secretion of the inflammatory cytokines (except MCP-1) compared to bevacizumab. These results were not statistically significant. All the treatments did not reduced the viability of the ARPE-19 cells under normoxia, chemical hypoxia and real hypoxia. Comparing the chemical hypoxia with cobalt chloride and the real hypoxia, the chemical hypoxia produced statistically different results regarding the secretion of 8 out of 10 pro-angiogenic cytokines (except EGF and HB-EGF), and the secretion of two inflammatory cytokines (IL-6 and IL-8). CONCLUSIONS: Amfenac reduced the secretion of pro-angiogenic cytokines (angiogenin, bFGF, and VEGF) and the secretion of all inflammatory cytokines under real hypoxia. Besides, except from MCP-1 and IFN-?, the combination of amfenac with bevacizumab tends to cause higher reduction of the levels of inflammatory cytokines secreted by ARPE-19 cells under real hypoxia than bevacizumab alone. Nepafenac may be a worth therapy for exudative AMD in combination with bevacizumab with additional benefits like the reduction of the frequency of intravitreal injections of anti-VEGF. Further studies are necessary to confirm this hypothesis. Compared with real hypoxia, the chemical hypoxia produced different results, sometimes statistically significant, regarding the levels of the pro-angiogenic and inflammatory cytokines secreted by ARPE-19 cells. This suggests that some cytokines function primarily associated with HIF-1?, while others do not.

Objetivo: Avaliar os efeitos do anfenaco (princípio ativo do nevanaco) e de sua combinação com o bevacizumabe sobre a secreção de citocinas pró-angiogênicas e inflamatórias pelas células do epitélio pigmentado retiniano (EPR). Adicionalmente, verificar se a hipóxia simulada com cloreto de cobalto (hipóxia química) tem o mesmo efeito que a hipóxia real (câmara de hipóxia) sobre a secreção de citocinas pró-angiogênicas e inflamatórias pelas células do EPR. Métodos: Células do epitélio pigmentado retiniano humano (ARPE-19) foram incubadas sob condições de normóxia, hipóxia química e hipóxia real. Os experimentos consistiram em quatro condições de tratamento: controle, bevacizumabe (0,25 mg/mL), anfenaco (2 ng/mL) e bevacizumabe (0,25 mg/mL) + anfenaco (2,0 ng/mL). Após 24 horas de tratamento, o meio de cultura das células foi colhido para análise dos níveis de 10 citocinas pró-angiogênicas: angiogenina, ANG-2, EGF, bFGF, HB-EGF, PDGF-BB, leptina, PIGF, HGF e VEGF, e 10 citocinas inflamatórias: IL-1?, IL-1?, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IFN-?, TNF-?, MCP-1. Para essa análise foram utilizadas técnicas que trabalham sob os mesmos princípios que o teste imunoenzimático ELISA (angiogenesis array e inflammation array). A viabilidade celular/citotoxicidade foi avaliada pelo LIVE/DEAD® viability/cytotoxicity kit da Invitrogen. Resultados: Sob normóxia, anfenaco aumentou a secreção de ANG-2, HB-EGF, leptina, PDGF-BB e PIGF, quase não alterou a secreção de EGF e reduziu a secreção de angiogenina, bFGF, HGF e VEGF; sua combinação com bevacizumabe aumentou a secreção de todas as citocinas pró-angiogênicas, exceto angiogenina, bFGF e VEGF, que tiveram sua secreção diminuída. Sob hipóxia química, anfenaco reduziu a secreção de todas as citocinas pró-angiogênicas, exceto a de ANG-2, que teve sua secreção aumentada, EGF e bFGF (tiveram secreção praticamente inalterada) e PIGF (que teve níveis indetectáveis pelo método sob efeito dos três tratamentos); sua combinação com bevacizumabe reduziu a secreção de todas as citocinas pró-angiogênicas, exceto ANG-2 e HGF, que tiveram sua secreção aumentada, e PIGF que apresentou níveis indetectáveis. Sob hipóxia real, anfenaco aumentou a secreção de todas as citocinas pró-angiogênicas, exceto angiogenina, bFGF e VEGF, que tiveram sua secreção diminuída; sua combinação com bevacizumabe aumentou a secreção de todas as citocinas pró-angiogênicas, exceto VEGF. Sob normóxia, anfenaco quase não alterou a secreção de IL-1? e IL-13, reduziu a secreção de IL-1?, IL-4, IL-8, IL-10 e IFN-?, e aumentou a secreção de IL-6, MCP-1 e TNF-?; sua combinação com bevacizumabe quase não alterou a secreção de IL-1?, IL-8 e IL-10, reduziu a secreção de IL-1? e aumentou a secreção das demais citocinas inflamatórias. Sob hipóxia química, anfenaco quase não alterou a secreção de IL-1?, IL-1? e IFN-?, reduziu a secreção de IL-10, IL-13 e TNF-?, e aumentou a secreção das demais citocinas inflamatórias; sua combinação com bevacizumabe quase não alterou a secreção de IL-1?, reduziu a de IL-10, IL-13 e TNF-?, e aumentou a secreção das demais citocinas inflamatórias. Sob hipóxia real, anfenaco reduziu a secreção de todas as citocinas inflamatórias; sua combinação com bevacizumabe também reduziu a secreção das citocinas inflamatórias, exceto a de IFN-?, que apresentou aumento de sua secreção; a combinação das drogas causou maior redução dos níveis de citocinas inflamatórias (exceto MCP-1) que bevacizumabe. Esses resultados não foram estatisticamente significantes. Os três tratamentos não reduziram a viabilidade das células ARPE-19 sob normóxia, hipóxia química e hipóxia real. A hipóxia simulada com cloreto de cobalto (hipóxia química) produziu diferença estatisticamente significante sobre a secreção de oito das dez citocinas pró-angiogênicas (exceto EGF e HB-EGF) e de duas citocinas inflamatórias (IL-6 e IL-8) comparada com o efeito produzido pela hipóxia real. Conclusões: Anfenaco reduziu a secreção de citocinas pró-angiogênicas (angiogenina, bFGF e VEGF) e de todas as inflamatórias sob hipóxia real. Além disso, com exceção da proteína quimiotática de monócito-1 (MCP-1) e interferon-gama (IFN-?), a combinação de anfenaco com bevacizumabe tendeu a provocar maior redução dos níveis de citocinas inflamatórias secretados pelas células do EPR sob hipóxia real que bevacizumabe sozinho. É possível que nepafenaco seja uma terapia válida para DMRI exsudativa em combinação com bevacizumabe podendo trazer benefícios adicionais como a redução da frequência de injeções intravítreas de anti-VEGF; mais estudos são necessários para confirmar essa hipótese. A hipóxia simulada com cloreto de cobalto (hipóxia química) produz diferenças (às vezes, significativa) na secreção de citocinas próangiogênicas e inflamatórias comparada à hipóxia real. Isso sugere que algumas citocinas têm sua função primariamente relacionada ao fator induzido pela hipóxia-1 alfa (HIF-1?), enquanto outras não.
Keywords amfenac
bevacizumab
cytokines
angiogenesis
inflammation
anfenaco
bevacizumabe
citocinas
angiogênese
inflamação
Language Portuguese
Date 2015-06-30
Published in MIYAMOTO, Cristina. Efeitos do anfenaco e de sua combinação com bevacizumabe sobre a secreção de citocinas pró-angiogênicas e inflamatórias pelas células do epitélio pigmentado retiniano. 2015. 115 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.
Research area Medicina
Knowledge area Ciências da saúde
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 115 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=2728322
Access rights Closed access
Type Thesis
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/46209

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